【求助】8k以上的质粒定点突变PCR实验条件

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标题:【求助】8k以上的质粒定点突变PCR实验条件

idea2011[使用道具]
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发表于 2014-10-28 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

定点突变一个8k以上的质粒，做了2次都不成功，后来点检测pcr产物，没有条带（我用的Phusion酶，延伸6min）。是不是buffer，dNTP，酶的浓度都要加大？延伸时间应该多久？求大神指导。

popo520[使用道具]
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发表于 2014-10-28 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

嗯首先要把质粒单酶切分别进单引物PCR,分别回收2个片段之后,混合PCR产物再进行第三次PCR(大引物PCR),回收连接便是你的新质粒了。你看看是不是哪...

idea2011[使用道具]
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发表于 2014-10-28 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 popo520 于 2014-10-28 16:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

嗯首先要把质粒单酶切分别进单引物PCR,分别回收2个片段之后,混合PCR产物再进行第三次PCR(大引物PCR),回收连接便是你的新质粒了。你看看是不是哪...

单酶切的目的是为了让模板双链更容易打开吗？单引物扩增成功率高吗？延伸的时间大概多少？

feima+[使用道具]
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发表于 2014-10-28 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

OE-PCR试试。

misswu61[使用道具]
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发表于 2014-10-28 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

某日本公司的kit倒是成功率很高，哪怕10kb。

utt0989[使用道具]
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