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标题:【求助】构建载体的酶切鉴定

purrr[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】构建载体的酶切鉴定

这是我提取质粒后双酶切坚定地图谱，marker是10000的，最亮的那个条带是2000大小。双酶切的酶是HindIII和BssHII,切完之后应该出现的插入基因条带大小为1916bp，但是现在酶切出现了这么多条带是怎么回事呢？而且我觉得2000的marker那里那个条带好像不太对。各位大侠有没有什么见解说一下吧。


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2014-10-28 17:25
20130607pDHBOV012双酶切鉴定.jpg (216.88 KB)
 
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

10000的marker应该是有8条带才对，你怎么才有7条，双酶切的话，除了目的条带，还应该有载体那条带呀。
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发表于 2014-10-28 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们的是takara的，就是只有7条载体，分别是250,500,1000,2000,4000,7000,10000.是应该有载体那条带，可是现在出现了差不多5条带啊，而且在靠近500那里也有一条带，而且我的目的条带不到2000，应该在2000下面靠近的位置吧。可是现在，在2000上面的位置有个条带，我觉得那条带好像应该不是我的目的条带。重复了很多次了，一直是这样的结果，不知道该怎么办了！
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的质粒是测过浓度之后才酶切的吗？是不是质粒浓度太大，酶切没完全。
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wood533[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问下你之前载体构建的时候有没有问题，然后提取质粒这一步是否会有问题。
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purrr[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得即使有的没有切开，但是肯定有切开的吧，只要有切开的就应该能连上一些啊，可是至今好像一直没有连上的样子。而且，我之前一直是这样的酶切体系。就是5ug左右的
质粒，用2ul的酶切。

反应体系是50ul，之前做的一直是这样的体系，都没有出过问题。

[ 本帖最后由 purrr 于 2014-10-28 17:30 编辑 ]
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发表于 2014-10-28 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是目的片段里含有酶切位点
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
切开了，但切出来的是500的条带。溴酚蓝上面有一层很淡的带，见了吗？？？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

质粒浓度太高，琼脂糖凝胶浓度偏高
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purrr[使用道具]
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发表于 2014-10-28 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wood533 于 2014-10-28 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想问下你之前载体构建的时候有没有问题，然后提取质粒这一步是否会有问题。

之前没有出过这样的问题。这次不知道为什么，找不出原因了！
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