【求助】求解PCR谜题

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标题:【求助】求解PCR谜题

jingling845[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠！本人最近做RACE，出现了很奇怪的问题！P出的结果跑琼脂糖凝胶，居然跑的时间不一样，条带大小也不一样！

附件

2014-10-29 16:19

503526.jpg (17.93 KB)

jingling845[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一个图是跑了15min的，显示条带在750bp偏下；第二个图是跑了20min的，同样的样品上面的显示1000+bp！！
顿时，小弟迷乱了！这难道不是DNA片段？？！！附鬼了不成！！？？

jingling845[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠面对过这样的问题吗？本人RACE GSP Tm=69，做的是Touchdown！出现这样的条带！起初以为没问题，本人切胶没有回收出来！于是就迷乱了！请各位大侠指点！！

youreyes[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一张图片的loading buffer 加多了，第二张是属于没有扩增好。

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 youreyes 于 2014-10-29 16:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
第一张图片的loading buffer 加多了，第二张是属于没有扩增好。

loading buffer加多有什么现象啊？谢谢！

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

marker正常，问题估计出在DNA扩增上，是不是引物不行，或者反应条件有问题

jingling845[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这两张图片是一个批样！跑的时间不一样！
关键第一个问题是：第一张图上边的带跟marker不同步！怀疑他不是核酸，但不是核酸又会是什么呢？！！！！？？？？
第二个问题是本人RACE Touchdown步骤温度已经68摄氏度了；没法再提高Tm了，但还是条带弥散！！
各位高手，给小弟支支招！！
不胜感谢！

seagate[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的最近两天也出现了这样的鬼画符，有的还有目标条带，以前不是这样的，加的东西都和以前一样，我怀疑是不是污染造成的。请问楼主的原因找到了吗？分享一下

fangxiang[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

电泳胶配的有问题，EB等染色剂没有混匀，或者是电泳缓冲液不是新鲜的，导致电压或者电流不对，第二张图中的marker不如第一张清晰

mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-10-29 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果是同一试管中的样品出现这种现象，而且图1中有些条带明显是弯的，那只能是电泳出现问题。PCR Touchdown 之后，看图片中目的条带弥散可能是扩增出来的不具特异性，可能是引物设计问题。