细胞生物学

一、动物细胞原代和传代培养

（一）培养液的配制

蒸馏水必须是新鲜的三蒸水。选用RPMI 1640培养液。

1.配1升RPMI1640培养液的粉末(1袋)+2gNaHCO3

2.溶于800mL三蒸水中充分搅匀

3.用HCl调节PH7.2-7.4

4.用蒸馏水补足1L

5.用灭菌滤器过滤（用φ0.45或0.20μm滤膜）

6.用灭菌瓶分装（学生实验）100ml/瓶

（二）磷酸盐缓冲液(PBS)的配制

pH
7.6
7.4
7.2
7.0

H2O

NaCl

Na2HPO4

NaH2PO4
1000

8.5

2.2

0.1
1000

8.5

2.2

0.2
1000

8.5

2.2

0.3
100mL

8.5g

2.2g

0.4g



（三）7.4% (W/V)  NaHCO3

（四）10000 IU / ml硫酸链霉素、青霉素G钾盐的配制

硫酸链霉素             1g

青霉素G钾盐     100万 国际单位（IU）

将上述两种药品溶于100mL生理盐水中，然后灭菌（过0.45μm的滤膜），分装于青霉素瓶中放－20℃保存。使用时可按100 IU／mL稀释。

（五）0.05%胰蛋白酶溶液的配制

1.      1g胰蛋白酶加入20mLPBS中

2.      37℃搅拌2小时

3.      4℃7000rpm离心20min  

4.      取上清灭菌（过0.45μm的滤膜）

5.      每10mL分装，放－20℃保存

6.      取10mL冻存的加入灭菌的PBS1L中，2％的EDTA(灭过菌的)10mL

7.      配成终浓度0.05％的胰蛋白酶

（六）0.3％台盼兰染液

      称取台盼兰(Trypan blue)粉0.3克，溶于100mL生理盐水中，加热使之完全溶解，用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。

（七）洗液

方法：先将重铬酸钾完全溶解于水中,如不溶可加热帮助溶解，然后缓慢加入浓硫酸。加浓硫酸时将产生大量热量，因此配制的容器宜用陶瓷，加入浓硫酸时要缓慢而不能过急，以免热量产生太多，导致容器破裂，发生危险。

次强液：重铬酸钾120g           强液： 重铬酸钾63g

               浓硫酸 200mL                    浓硫酸1000mL

               蒸馏水1000mL                   蒸馏水 200mL

二、脂类染色

10％中性福尔马林      甲醛      100mL     磷酸二氢钠    6.5g

                                           蒸馏水  900mL

苏丹Ⅲ染液               苏丹Ⅲ  0.1g       95%酒精       20mL

苏丹黑染液               苏丹黑  0.5g       70%酒精      100mL



三、石蜡切片

      卡诺氏固定液            100%酒精  3份     冰醋酸  1份

      埃利希苏木精染液    苏木精      1.0g       乙醇       50mL   

                                          醋酸          5mL       甘油       50mL

                                          硫酸铝钾  5g           蒸馏水   50mL

      将苏木精溶于15mL的乙醇中，再加醋酸并搅拌，以加速其溶解。当苏木精溶解后将甘油加入并摇动容器，同时加入其余的乙醇；硫酸铝钾需研磨并加热，然后溶解于蒸馏水中，将其一滴滴地加入上边的溶液，并不断摇动，此液配好后，将瓶口用纱布盖好，置通风处，经常摇动以加速其成熟，成熟约需4周左右，成熟的染液为深红色。

      1%伊红酒精溶液      伊红      1.0g      95%酒精    100mL

      1%盐酸酒精溶液      盐酸      1 份      70%酒精     100份

      郝普特氏粘片剂     明胶      1.0g      蒸馏水         100mL

                                          石炭酸   2.0g      甘油             15mL

      配制时明胶溶解于30℃的蒸馏水中(水浴锅中进行),溶解后加入石炭酸和甘油,搅拌均匀过滤,贮存于玻璃瓶中.

1%番红染液         番红     1.0g       蒸馏水  100mL

1%固绿染液       固绿     1.0g       蒸馏水  100mL



四、PAS反应

      1%过碘酸                   过碘酸   1.0g        蒸馏水  100mL

      1 mol/L（V/V）HCl            浓盐酸   8.5mL     蒸馏水  91.5mL

0.5%偏重亚硫酸钠溶液   偏重亚硫酸钠  0.5g  蒸馏水  100mL

      Schiff试剂          蒸馏水100mL煮沸后取下，立即放入碱性品红1g使之溶解。冷却至50℃时用滤纸过滤。加偏重亚硫酸纳（或钾）（或亚硫酸氢盐）2g及1mol/L HCl 20mL。避光放置18～24h（室温）。溶液变为草黄色。然后加入300mg活性炭，用力摇动1min，过滤。过滤后即得无色品红。

     此液配就后，封严瓶塞，外包黑纸，贮于4℃冰箱备用，用前升至室温。



五、核酸的细胞化学（Feulgen反应）

     1mol/LHCl          浓盐酸   8.5mL     蒸馏水  91.5mL

      1％亮绿染液        亮绿       1g             蒸馏水  100mL

      Schiff试剂         蒸馏水100mL煮沸后取下，立即放入碱性品红1g使之溶解。冷却至50℃时用滤纸过滤。加偏重亚硫酸纳（或钾）（或亚硫酸氢盐）2g及1mol/L HCl 20mL。避光放置18～24h（室温）。溶液变为草黄色。然后加入300mg活性炭，用力摇动1min，过滤。过滤后即得无色品红。

      此液配就后，封严瓶塞，外包黑纸，贮于4℃冰箱备用，用前升至室温。



六、液泡系及线粒体的活体染色

Ringer溶液          氯化钠             0.85g（变温动物用0.65g）

                                氯化钾             0.25g

                                 氯化钙             0.03g

                                蒸馏水             100mL

1％的1/5000詹姆斯绿B溶液称取50mg詹姆斯绿B溶于50mLRinger溶液混匀，稍加 热（30～40℃）使之溶解，用滤纸过滤，即为1％原液。取1％原液1mL加入49mLRinger溶液，即成1/5000工作液。将其装入瓶中备用 。最好现用现配 ，以保持  它的充分氧化能力。

1％的1/3000中性红溶液    称取0.5g中性红溶液溶于50mLRinger液，稍加热（30～40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存。临用前，取已配制的1％中性红溶液1mL加入29mLRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。



七、细胞融合

Alsever溶液：       葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，

                                     溶于100mL双蒸水中。

GKN溶液：           NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，

                                      NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，

                                     溶于1000mL水中。

50％PEG溶液：    称取一定量的PEG（WM＝4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混匀，置37℃备用。