小中大细胞培养 cdc msck培养sop
一、目的
MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。
二、适用范围
适用于疾控中心所有技术人员 。
三、程序
（一）生物安全要求
实验室生物安全级别：BSL-1
所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。
（二）材料
1. 生长成片的MDCK细胞
2. 无菌的T25细胞培养瓶
3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）
4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
5. HEPES缓冲液，1M母液
6. 胎牛血清
7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃
8. 7.5%牛血清白蛋白组分V
9. 1mL、10mL无菌移液管
10. 70％～75％的酒精
注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
（三）实验步骤
这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
1. D-MEM培养液的准备
500mL D-MEM液中加入：
青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），
HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
2. 细胞生长液的准备
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）
9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
