【求助】做PCR出来的条带老是二聚体是怎么回事啊？

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】做PCR出来的条带老是二聚体是怎么回事啊？

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】做PCR出来的条带老是二聚体是怎么回事啊？

PCR[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74238
精华 0
积分 414
帖子 448
信誉分 100
可用分 3201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态离线

发表于 2014-11-28 21:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物调整了好几次，模板也用的是师兄的模板，应该不会有什么问题，可是扩出来还是二聚体。有没有哪位大神指导指导啊？

yapuyapu[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76072
精华 3
积分 574
帖子 695
信誉分 106
可用分 4338
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2014-11-28 21:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物浓度太高

gogo[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77052
精华 0
积分 821
帖子 1341
信誉分 100
可用分 7487
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2014-11-28 21:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

适当提高模板浓度，降低引物浓度

dreaming[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71302
精华 0
积分 371
帖子 441
信誉分 100
可用分 3016
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2014-11-28 21:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提高模板，减少引物也同样问题，怎么办

kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2014-11-28 22:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能引物不好，也可能是引物加的太多，一般50ul体系加1u（10uM）l即可

wanglaoshi[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77295
精华 0
积分 449
帖子 597
信誉分 100
可用分 3796
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

发表于 2014-11-28 22:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是退火温度不合适吧，建议用公式算一下：Tm=4（G+C)+2(A+T)。然后用梯度PCR（退火温度为计算温度+或—5至6度）筛选出最佳温度。筛选标准有：看有无引物二聚体出现或与maker比较电泳条带的亮度。

hold住[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2014-11-28 22:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物P不出来，各种因素都试验了还不出来，就是引物问题，对吧

hold住[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2014-11-28 22:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二聚体不就是引物的问题么，当然如果引物浓度高的时候，二聚体更严重，但是最主要原因还是引物设计不好，带来了形成二聚体的风险

ha111[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 72969
精华 0
积分 821
帖子 1239
信誉分 101
可用分 7048
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态离线

发表于 2014-11-28 22:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意6楼，严格意义上来说，二聚体是很难避免的。只是二聚体多少的问题。如果多次调整引物任然只有二聚体的话，建议从PCR反应的循环条件上查找问题。可以试下TD。