【求助】大神们帮我分析下我的PCR怎么了？

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标题:【求助】大神们帮我分析下我的PCR怎么了？

dotaaa[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的问题是这样的，使用同样的条件同样的体系同样的模板，但是最近开始pcr开始出现拖尾现象，直至这几天我们的PCR完全扩增不出来了，谁能帮忙分析下可能的原因最后一次的图片是这样的，怀疑根本没有扩增出来，第一条是100bp 的marker，2到7条的目的片段应该200到300bp之间，8到11的目的片段应该在400到500bp之间，求帮忙啊！！！谢谢大家啦!!!!

附件

2014-11-28 22:36

Administrator 2013-05-03 14hr 36min.JPG (23.49 KB)

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据的我自己的PCR经验，这里可能有三种原因：
一、可能你的模板内部有很多的重复序列
二、你的模板的gc含量较高，你在用PCR技术时退火的温度较低，导致杂带现象很严重
三、可能你得到的模板DNA纯度不是太好，里面含有大量的蛋白质杂质

zbboom[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从结果看，可能是1）非特异扩增；2）模板降解
我想会不会是你使用的酶使用次数多了或是保存不当等原因，使得酶的活性降低引起非特异扩增？
还有你的模板是什么？如果是一步法 RNA模板确实容易降解。

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

后面三个孔的退火温度可以升高一些

dotaaa[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ladyhuahua 于 2014-11-28 22:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

根据的我自己的PCR经验，这里可能有三种原因：
一、可能你的模板内部有很多的重复序列
二、你的模板的gc含量较高，你在用PCR技术时退火的温度较低，导致杂带现象很严重
三、可能你得到的模板DNA纯度不是太好，里面含有大量的 ...

可是原来条件和现在是一样的，模板也是一样的，开始是能扩出来的啊

dotaaa[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zbboom 于 2014-11-28 22:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

从结果看，可能是1）非特异扩增；2）模板降解
我想会不会是你使用的酶使用次数多了或是保存不当等原因，使得酶的活性降低引起非特异扩增？
还有你的模板是什么？如果是一步法 RNA模板确实容易降解。
...

我使用的是人血DNA的模板，之前所有的条件都是一样的，可以扩出来，忽然就扩不出来了。。。酶也是新换没多久

dotaaa[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ilovegaga 于 2014-11-28 22:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
后面三个孔的退火温度可以升高一些

原来的所有条件和现在都是一样的，可是原来是可以扩出来的，现在忽然就扩不出来了不知道是什么原因啊。。。

子衿青青[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dotaaa 于 2014-11-28 22:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

原来的所有条件和现在都是一样的，可是原来是可以扩出来的，现在忽然就扩不出来了不知道是什么原因啊。。。

是不是你的模板质量不一致啊？
再者，你再摸一下引物的退火温度

jingling845[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加入适量DMSO或者Betaine试试看呢。。。

dotaaa[使用道具]
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发表于 2014-11-28 22:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 子衿青青 于 2014-11-28 22:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是不是你的模板质量不一致啊？
再者，你再摸一下引物的退火温度