小中大(四)电泳
1.电泳装置:
电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.
2.电泳方法:
(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.
(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.
3.配制0.5XTbE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.
4.向电泳槽中倒入0.5XTbE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有 气泡，应设法除去.
5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.
6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).
7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的pCR产物50V电压， 电泳20～40min即可.
(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小.
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离.
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.
聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围见表2.
丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青*
3.5 100～2000 100 460
5.0 80～500 65 260
8.0 60～400 45 160
12.0 40～200 30 70
15.0 25～150 15 60
20.0 10～100 12 45
*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).
(一)材料
1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.
2.30%丙烯酰胺
丙烯酰胺，29克
N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克
H2O，加至100ml
装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.
3.10%过硫酸铵
过硫酰铵，1克
加水至，10ml
4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.
4.1XTbE电泳缓冲液
5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)
(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳
根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.
1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.
2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.
3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.
4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体接近溢出时为止.
5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10°角，可减少液体泄漏的机会.
6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTbE 缓冲液.
7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.
8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡.
9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.
10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.
11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.
12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染.
