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标题:【求助】请教Real-Time PCR标准曲线制作

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发表于 2014-11-29 09:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教Real-Time PCR标准曲线制作


如题，本人新手，在做荧光实时定量pcr，因牵涉到标准曲线的制作问题，不是很清楚，所以请高手指教，非常感谢！
设置时well type选的是standard，然后下边的copies也赋值了，内参和目的基因一起跑的，跑完以后显示的标准曲线如下图，好像不是我们用2 -△△CT 方法时所要的标准曲线，就是要求斜率接近于0的那个，因为那个纵坐标的为△CT，而这个standard curve的CT值就是实际的值，我不确定是不是2 -△△CT 方法时所要的标准曲线是自己做出来了吗？曲线方程也是自己计算的吗？假如这样的话目的基因和内参是不是就没必要一起跑了？


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发表于 2014-11-29 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上边这个图是目的基因和内参一起的，没有分开。再发一个目的基因的


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发表于 2014-11-29 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个是内参的


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发表于 2014-11-29 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相对定量的时候并不需要标准曲线
只有绝对定量需要标准曲线
标准曲线目的基因和内参需要一起跑，否则没有意义~
从图上看你的稀释范围不太够，我们一般从10的-2 一直做到10的-9
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发表于 2014-11-29 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是我的稀释到10-5时内参就跑不出来了啊，我做的是病毒的，蛋白含量很低
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发表于 2014-11-29 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么没人回答我啊？是不是就是把目的基因和内参在一起跑，然后根据其CT值之差自己计算制作标准曲线啊？我真的是不确定，谢谢啦
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发表于 2014-11-29 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

内参和目的基因的标准曲线分别作，但是做好是同时加样，同一次PCR程序跑，以减少操作误差和仪器误差，，软件会自动给你标准曲线吧，你上面那个标题是standard curve的图不就是你的标准曲线吗。
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发表于 2014-11-29 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上回答，我第一个标准曲线是内参和目的基因一块的标准曲线，下边的两个是我把它们分别取的标准曲线，但是还是在一块跑的。我们用delta delta CT法分析时要求的是内参和目的基因扩增效率一致，就是做的标准曲线斜率接近于0，但是我这个标准曲线不是啊，斜率跟0差得远呢，应该不是看这个标准曲线的吧，是自己重新再做一个？
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发表于 2014-11-29 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再请教个问题，在用2-△△ C T 方法分析数据时，制作的那个标准曲线是自己根据目的基因和内参的Ct值之差制作的吗？就是以△ C T 值为纵坐标，以标准品稀释倍数为横坐标，通过  cDNA 浓度梯度的  log 值对△ C T 值作图，看直线的斜率是否接近于0.我看到好多文章都引用的这个例子，标准曲线是y=0.047log(x)+3.017,R2=0.219，我想请问一下，这个log(x)没底数怎么计算出这个方程式啊？还有就是R2表示什么？谢谢！请帮我解答。
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发表于 2014-11-29 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以我的经验，是要自己再做一个的，有关文献上有过具体描述~~~~

至于目的基因和内参基因一起跑是什么意思，放在一个反应体系里跑吗？还是实验同时进行的，但在不同管中跑的？

我是在不同管中，同时进行实验的，然后自己制作曲线，看斜率是多少？

PS：不过我也想知道机器上可以直接给出这个斜率关系吗？我至今还不知道~~~~希望有人指正~~~~
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