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标题:【求助】PCR产物琼脂糖凝胶电泳

daod[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR产物琼脂糖凝胶电泳

请问各位老师，这张图中的中间那个月牙形的条带是怎么产生的，而且如果继续跑等Marker全部跑开时，又会消失的......对此本人是相当的困惑，求解！！！！还有就是这块胶上黑下白，是什么原因？注，胶上上的样全是同一基因的pcr产物，片段大小420 。如果有目标条带应该就是图中比较亮的条带，如果没有目标条带应该是除了引物二聚体就不应该有别的东西了。


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2014-11-29 09:27
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，这个图中的marker都没跑开，建议90V跑35分钟，应该能跑开，上黑下白这是照相问题，建议分开照，这么多样的话点样时间估计较长，样品在孔里面弥撒了，建议分三次跑。
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
跑的效果还是比较可以的，建议增加电压100V20-40min试试。祝楼主成功！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是加EB的吗？
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daod[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2014-11-29 09:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
是加EB的吗？

嗯   是加EB的
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daod[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2014-11-29 09:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
首先，这个图中的marker都没跑开，建议90V跑35分钟，应该能跑开，上黑下白这是照相问题，建议分开照，这么多样的话点样时间估计较长，样品在孔里面弥撒了，建议分三次跑。 ...

这张图是我在marker跑到到中间时拍的，所以mark而还没有完全跑开，但是我现在的弄清楚 ，图中的月牙形的条带是怎样产生的，加样我是使用排枪加样的，从上往下加的，如果是因为条带散开的话，那也应该是最上面的会有月牙的。我的PCR体系是没有问题的，我是做了两个touchdown的最后再加35个循环。之前也做了这个基因，没有这种问题，是阳性的样本就会出现上边450左右bp目标条带，如果不是阳性就没有条带，可是现在做出来的大部分都有月牙性的条带，所以现在比较困惑.......
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bojitu[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不但Marter没跑开，

条带还有拖尾现象，

原因如下：1：样品浓度过高。这种情况稀释一下就行了。提质粒的时候常出现这种情况。

2：蛋白杂质阻碍DNA的泳动。提基因组DNA时常出现这种情况。

以上两种情况，拖尾都是在电泳条带的后面。

3：样品破碎或是被降解

4：存在RNA

建议：

①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。
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october7[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好像基本都是引物二聚体吧 除了少数几个
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