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标题:【求助】 看看我的PCR跑出来为什么这样的

tudou85[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 看看我的PCR跑出来为什么这样的

这是我昨天做的温度梯度pcr电泳结果图，我是扩基因，怎么会有两条带呢？我的片段长度是831bp，上游引物退火温度是62，下游引物是58.2，酶用的是KOD高保真酶，扩增40个循环，2-4孔的温度梯度分别是52.3、53.2、54.3、56.6，第一个孔是单独做了一锅53度的。。大家给点建议。。。


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2014-11-29 09:50
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
给你点建议，
第一、以后把marker大小写出来，
第二，设置梯度可以是上下游引物温度的平均值上下5度来这样设置，比如对于你的引物，可以设置为（62+58.5）/2=60.25，即55度到65度，所以说你的梯度设置有问题的
第三、你的胶可以再跑一下，条带都没有跑开
第四、有两条条带说明一个问题，你的引物的特异性不好。
就这样
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tudou85[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 yjf1026 的帖子

谢谢你的建议。我的引物是2000的，曾跑过一次55度的，没出带。至于引物，我正准备重新设计一对。。再次感谢。。
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发表于 2014-11-29 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的条带太多，应该是引物问题，重新设计下引物吧，或者试试提高退火温度（可减少非特异性扩增）
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发表于 2014-11-29 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

确实，把marker跑开点，引物也不好，祝你成功
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物设计有问题
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leifengta[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看看你的引物  会不会扩增 目的片段里的其它部位  你可以重新设计引物   或者把2条都回收了 然后寄出去测序  挑你需要那段
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发表于 2014-11-29 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

二楼分析的很有道理。重新设计一下引物吧
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发表于 2014-11-29 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
退火温度低了。可以尝试58℃或更高的温度梯度。如果试过后不出，可以看你扩增的片段是不是困难模板，加增效剂试试。如果还是出两条带，那你还是看看引物的设计是不是有问题，换对引物试试。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2014-11-29 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非特异性扩增，引物有问题，不行就用天根的Taq plus得了，高保真酶不怎么好。
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