PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】荧光定量PCR扩增曲线太平缓

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】荧光定量PCR扩增曲线太平缓

yhz1973[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79832
精华 0
积分 439
帖子 538
信誉分 100
可用分 3540
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
1

发表于 2014-11-29 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量PCR扩增曲线太平缓


大家好，我是刚开始做荧光定量pcr。做的事Taqman探针法荧光定量，现在还在摸条件中，用的是takara的预混酶。做了几次扩增曲线都很平缓。附图就是我做的结果，想向各位请教一下，该怎么改进。
顶部
toy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77357
精华 0
积分 716
帖子 1052
信誉分 100
可用分 6165
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
2

发表于 2014-11-29 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物探针设计信息能给看下嘛？
顶部
yhz1973[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79832
精华 0
积分 439
帖子 538
信誉分 100
可用分 3540
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
3

发表于 2014-11-29 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 toy 于 2014-11-29 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
引物探针设计信息能给看下嘛？

多谢回复
引物TM值52.74,GC含量44.44%。探针TM61.9，GC含量60%
我做的是鸡传贫的。现在做了低浓度的，发现曲线还可以，就是低浓度的分不开。水里面也老是能跑出来。帮忙看看吧
顶部
yhz1973[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79832
精华 0
积分 439
帖子 538
信誉分 100
可用分 3540
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
4

发表于 2014-11-29 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kent 于 2014-11-29 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

扩增效率不高，是不是模板GC含量较高，或者上下游引物Tm相差比较大。

多谢回复。模板GC含量都是44.44%，TM值也都一样，都是52.74.
现在的问题是低浓度分不开。
顶部
yhz1973[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79832
精华 0
积分 439
帖子 538
信誉分 100
可用分 3540
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
5

发表于 2014-11-29 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的，多谢啦。我试试。我之前做过用两步法，退火延伸在一起60°，但是感觉还是跑不开。我明天再试试降低延伸温度吧。
顶部
junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
6

发表于 2014-11-29 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
降解了，扩增效率不高
顶部
nn255[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
7

发表于 2014-11-29 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该先用SYBR预混业看看引物的扩增效果怎么样，SYBR曲线典型S型，那么俺估计就是探针的问题了。
探针法引物和探针的浓度及配比优化时很麻烦的。
顶部
yhz1973[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79832
精华 0
积分 439
帖子 538
信誉分 100
可用分 3540
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
8

发表于 2014-11-29 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 nn255 于 2014-11-29 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
应该先用SYBR预混业看看引物的扩增效果怎么样，SYBR曲线典型S型，那么俺估计就是探针的问题了。
探针法引物和探针的浓度及配比优化时很麻烦的。

谢谢，我已经摸好条件啦
顶部