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标题:【求助】荧光定量PCR跑出来的扩展曲线怪异

bongte[使用道具]
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发表于 2014-11-29 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量PCR跑出来的扩展曲线怪异

用PROMEGA的试剂，罗氏480的仪器，跑出来的扩增曲线不典型，请大家帮忙分析原因。分别对模板做过2、4、8倍稀释，模板为标准菌株，但结果还是一样。
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dodoit[使用道具]
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发表于 2014-11-29 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

扩增效率低，如果你用的是试剂盒，原因主要有：没有优化最佳的退火温度，模板中含有其他抑制扩增的成分。如果是自己的试剂就可能还有溶解混匀方面的原因。没必要做2，4，8倍，可以以10倍递进稀释。
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bongte[使用道具]
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发表于 2014-11-29 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上，我用的是promega的试剂盒，引物TM值为50度，退火温度我尝试过50度、55度结果都是这样，没有平台期。我看它的荧光强度这么大，为什么说模板中含有其他抑制扩增的成分，模板已经过纯化。请各位为我指路，我都不知道该怎么处理了。
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any333[使用道具]
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发表于 2014-11-29 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
降低探针浓度
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发表于 2014-11-29 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是染料法，已降低引物浓度到0.05uM，但还是不能解决不能到达平台期的问题。
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pulala[使用道具]
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发表于 2014-11-29 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是染料法还是探针法啊
感觉是扩增效率的问题 模板是不是不纯
优化下条件吧
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-11-29 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
0.05um的引物浓度会不会太低了，我做HRM用的是200um的
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bongte[使用道具]
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发表于 2014-11-29 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

模板已经过纯化，估计是扩增效率的问题，罗氏工程师也到过现场一起尝试过，但还是不能到达平台期，换过罗氏的试剂结果也一样，因为模板GC含量很低，AT含量特高，工程师估计是这个问题导致扩增效率低。温度，延伸试剂都调整过，但还是没有明显效果。
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