【求助】荧光定量PCR的扩增曲线前几个循环翘起 - 经验共享 - 分析测试百科

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标题:【求助】荧光定量PCR的扩增曲线前几个循环翘起

woshi[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【求助】荧光定量PCR的扩增曲线前几个循环翘起

求助大家个问题，小弟在做RT-pcr时用的是质粒模板，探针是英俊合成的，仪器是Roche的LC480.不知道为什么扩增曲线总是出现前几个循环翘起的现象。然后使用Roche原装的试剂进行重复实验，类似的现象还会出现。小弟初步认定是探针的问题，但是之前一直使用的是英俊的探针，没有出现过类似的现象啊。请教各位有没有出现过类似的现象？怎么样调整实验解决这个问题呢？

DDD[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的荧光阈值设在哪里？如果这些“翘起”在阈值之下的话，可能是PCR扩增前期的一些波动引起的，影响不大。

whitesheep[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

完全无需考虑。。。

bgf5[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前面背景是仪器运行校正时产生的噪音带，可以不用考虑

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果是个别情况一般说来，都是模板纯度不太好造成的，一般提取试剂中经常会有一些不合格的柱子什么，或者提取的手法有点问题，也可能是样本本身就不太好。如果这个情况比较常见，则是引物探针的问题。

utt0989[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以运行几个循环不收集荧光，后面的循环数再收集，这样曲线图可以漂亮又不用重新设计啊

daod[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我记得3-15个循环有背景荧光，应该无妨的。

daod[使用道具]
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发表于 2014-11-29 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我看你的扩增曲线，和我实验中的一样，Ct值较大，大于30了，遇到这样子的情况怎么改进？？借你的地盘，求帮助！