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标题:【求助】PCR结果求助

call[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR结果求助

用EF-1基因对同一植物的cDNA进行pcr，但是结果很奇怪，有的样品有两条带，有的只有一条。还有大小不一样的条带。同一个植物的cDNA,相同的引物。应该是相同大小的条带才对呀。本来想拿这个基因做内参的，这种状况肯定不行呢。跪求大侠们帮忙解释一下下，非常感谢！


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2014-11-29 16:35
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个基因存在可变剪接吧
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fangxiang[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
插队：为啥这个胶上下部分颜色不一样？
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发表于 2014-11-29 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有用过EF-1做过内参。但是这样的PCR结果做内参肯定不行啊，一般做内参的基因并不多，而且都被高频率使用，楼主PCR反应体系是自己摸索的，还是参考与文献呢？

而且不知道楼主是不是胶图上所有泳道都是同一PCR批次做的内参基因，一块胶上的扩增产物最好是一次PCR反应扩增的结果，这样能够尽可能消减误差。内参PCR应该比较容易做，结果不好，要么是PCR体系不合适，要么是操作带来的问题。

个人浅见，希望能够对你有点帮助~
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feima+[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个基因存在可变剪接吧

=========================================================

splicing variation，可能存在这种情况，内参设计引物，应该避开这些区域吧?
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call[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
插队：为啥这个胶上下部分颜色不一样？

========================

这个是实验室拍照的关系的~~~
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发表于 2014-11-29 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有用过EF-1做过内参。但是这样的PCR结果做内参肯定不行啊，一般做内参的基因并不多，而且都被高频率使用， ...

============================================

是一次PCR的结果，可能就是引物设计不到位吧。谢谢哦
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是PCR中出现的非特异性结合，和体系有关，和选的聚合酶也有关
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kswl870[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR仪器不一定能保持每一个位置都一样，有的排温度低点，有地高点，
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qqq111[使用道具]
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发表于 2014-11-29 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
猜测：你的RNA中有基因组DNA杂质，可以验证一下，用内参的整个序列检查一下你用的引物扩出的目的条带大小，是否和以内参CDS序列为模板扩出的条带一致。二者因为内含子的关系，条带会不一样。祝你好运。
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