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标题:【求助】定量 pcr曲线分析

youyou99[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】定量 pcr曲线分析

这是我目的基因的定量pcr图片，actin的图片跑得很好，没有上传，但是这个基因里面就有的跑的好，有的就像两个小峰，这是怎么一回事啊？求高手答疑。模板浓度也测了，相差不多啊。
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这张图中较高的峰的峰行还不错基本是单峰，主峰较小的那个有小峰有两种可能，要么是非特异性扩增，要么是引物二聚体，如果出峰时间过早的话应该是引物二聚体，要是与主峰相伴而出的话应该是非特异性扩增，后者的话可以提高一下镁离子的浓度或者提高一下退火温度看看，要是还不行，只能重新设计引物。另外图中缺少阴性对照。
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555444[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个应该是不同的样本吧，来源一样吗？虽然模板浓度一样，但是同个基因在不同样本中的表达不一样的，同时在不同样本中同个引物也有不同的产物，我觉得可能是某几个样本中该基因表达过少，或者样本中有其他干扰因素。
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发表于 2014-12-1 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有双峰的应该是样本RNA提取时不纯还有基因组DNA或者是非特异扩增，因为明显变性温度较主峰高。设计引物是可以考虑跨外显子。弥补的方式可以用DNA酶消化DNA。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得这个和浓度没多大关系吧，你每个样都用Actin做内参已经排除浓度所造成的误差了。有可能是引物二聚体或者设计的引物特异性不。是不是你的样品可以大概分为两个群体，或者你的基因是个家族，这个可能性应该不大吧？
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 555444 于 2014-12-1 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个应该是不同的样本吧，来源一样吗？虽然模板浓度一样，但是同个基因在不同样本中的表达不一样的，同时在不同样本中同个引物也有不同的产物，我觉得可能是某几个样本中该基因表达过少，或者样本中有其他干扰因素。
...

是6个模板，每个模板做了3个重复
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qqq111 于 2014-12-1 11:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我觉得这个和浓度没多大关系吧，你每个样都用Actin做内参已经排除浓度所造成的误差了。有可能是引物二聚体或者设计的引物特异性不。是不是你的样品可以大概分为两个群体，或者你的基因是个家族，这个可能性应该不大吧？
...

我的6个模板确实是两组，每组三个模板 每个三个重复，但即使是不同组 他也应该是单峰啊？
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小游abc 于 2014-12-1 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这张图中较高的峰的峰行还不错基本是单峰，主峰较小的那个有小峰有两种可能，要么是非特异性扩增，要么是引物二聚体，如果出峰时间过早的话应该是引物二聚体，要是与主峰相伴而出的话应该是非特异性扩增，后者的话可以提高一下镁 ...

呃，我是初学定量的。出蜂时间怎么看啊？退火温度的话，已经选了摸索梯度的最高温度了，还能提高吗？
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发表于 2014-12-1 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是的，我的样本是从动物体内取得，是内寄生昆虫，所以想知道，这个结果是因为引物设计不好呢？还是有 ...

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这种非特异性扩增就分三种，一种是针对你提到的寄主或者基因组，另一种是寄生虫的总基因组。可以对引物针对寄主总mRNA及总基因组做一个primer blast，以看是否有非特异性扩增。基因组的话可以通过RNase-free的DNase处理，但是如果是因为寄主mRNA污染造成，估计只能通过重新设计引物来解决。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2014-12-1 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的6个模板确实是两组，每组三个模板 每个三个重复，但即使是不同组 他也应该是单峰啊？

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有可能是你设计的引物正好对另一个群体特异性不好，家族的突变位点有的时候还是蛮多的
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