【求助】phusion高保真酶扩增的问题

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标题:【求助】phusion高保真酶扩增的问题

avi317[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前几天用KOD高保真酶扩3kb左右的片段，做出来测序，错误率比较大。后来改用了phusion高保真酶扩条带，可是一直没做出来。想问问有没有用phusion高保真酶做过的？变性温度真的是98度吗？有没有pcr体系参考下~~

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没用过这种酶事实上还是按其说明说操作毕竟这样的酶很特别

avi317[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 chuntian1983 于 2014-12-1 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
没用过这种酶事实上还是按其说明说操作毕竟这样的酶很特别

问题是一直没做出来~~很纠结~~

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果是KOD都能扩出来，但又想保证高保真那就试试LA Taq吧毕竟phusion高保真酶既要保证扩增速率又要保证高保真两者很难兼得或许引物的问题最为关键了

avi317[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #4 xueyouzhang 的帖子

已经搞定，条带已经扩出来了~~说明书上说phusion高保真酶扩增15—30s/kb，但实际上不行的。还是要1min/kb。不明白说明书上为什么那么写~~

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #5 avi317 的帖子

哦你原来的程序不是1min/kb啊看来经你一说我对说明书上的速率不这么相信了

join[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 avi317 于 2014-12-1 15:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
已经搞定，条带已经扩出来了~~说明书上说phusion高保真酶扩增15—30s/kb，但实际上不行的。还是要1min/kb。不明白说明书上为什么那么写~~

我刚买了这个酶，还没用过呢是不是除了延伸时间其他的就按说明书上的来啊？

daod[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

打电话问公司，这种比较少用的酶还是问清楚较好

gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

高保真酶不能直接用于TA克隆，请你问，你高保真出来的片段是用的什么载体克隆测序的。