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小弟这几天准备做无缝克隆， 这设计引物时遇到一点困难，这此请教广大的螺旋友，不胜感激
1：引物的5‘端15-20bp与线性载体的同源序列要和后面的特异性序列加在一块考虑GC含量和TM值吗？还是除去同源序列区，计算后面特异性序列的TM值一GC含量。后面的特异性序列多少比较合适？
2:当pcr产物和线性载体重组时，那个线性载体酶切的黏性末端是丢弃，还是补齐再发生重组？
3：重组完成时线性载体两端的酶切位点还有吗？
From:
详见下列链接中的cuturl('http://www.rockgenebio.com/newsview.asp?id=56')
GBClonart引物设计方法中的示意图。
1、引物的5'端15-20bp是与线性载体的3'末端重复15-20bp序列即可，与特异性序列加在一起后需要考虑GC含量和TM值得变化，这种无缝克隆的引物较普通的引物长15-20bp，大约大于40bp。在设计引物的时候，引物合成公司会帮你把TM值算出来的。超过普通长度的引物，TM计算的公式不一样，请注意。
2、如果载体末端是粘性末端，一般采用同源的是末端那个稍长的一条，重组的结果应该是那个补齐后的结果，但整个过程只有重组。如果你设计同源的是粘性末端短的那一条，那么重组结果应该是未补齐的结果。
3、如果15-20bp的引物中含有酶切位点，则还在，如果不含，则不再。
