【求助】请前辈们进来看看：引物非特异现象严重。

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标题:【求助】请前辈们进来看看：引物非特异现象严重。

docsy[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 这是我的帖子：[url=请前辈们进来看看。引物非特异严重。 cuturl('http://bbs.bbioo.com/forum.php?m') ... &fromuid=328496]请前辈们进来看看。引物非特异严重。 cuturl('http://bbs.bbioo.com/forum.php?m') ... &fromuid=328496[/url]

2为解决非特异性问题，我做了退火温度优化的实验（55°-75°）见下图

附件

2014-12-1 17:04

3.jpg (14.42 KB)

docsy[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

由电泳结果发现：在55°-67.7°时候，非特异性条带（100bp-250bp）和特异性条带（480bp）都一起出现，当退火温度在69.4°时，目的条带没了，反而非特异性条带还在。(呜呜呜呜呜.........好郁闷）。是不是我体系弄得不好，请前辈们师兄师姐们能多多给给我宝贵的意见。

我使用的试剂为宝生物的试剂，所有的都是他家的试剂。
反转录体系：(总共10ul)
               RNA模板                         5ul
               5xMlV Buffer                      2ul
               dNTP Mix (2.5mM each) 0.5ul
               RNase Inhibition (40U/ml)    0.5ul
               RTase MlV  (200U/ml)          0.5ul
               DEPC H20                         0.5ul
               特异性下游引物 (10uM)    1ul
反转录程序是：引物与模板70°十分钟，加入其它成分，42°一个小时。
pcr体系：（共50ul）
            E-Taq酶 (5U/ml)                   0.5ul
            10xE Taq buffer(不含Mg离子) 5ul
            Mgcl2（25mM）                   4ul
            dNTP  Mix (2.5mM each)       8ul
         模板cDNA                            2ul
         上下游引物  (10uM)                各1ul
         dd 水                                  28.5ul
PCR程序:94°          3min
         94°          30s
         55°             30s
         72°             1min 循环数30个
         72°             10min

ha111[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有没有考虑到是引物的问题是否可以考虑更换引物

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对呀，你再重新设计一对引物看看结果怎么样

docsy[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ha111 于 2014-12-1 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有没有考虑到是引物的问题是否可以考虑更换引物

再设计的话，需要注意什么，才能除掉这个顽固的非特异性条带（100-250bp）呢？？

docsy[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dodoit 于 2014-12-1 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
对呀，你再重新设计一对引物看看结果怎么样

现在看来，也考虑重新设计了，虽然有些不想，可是好像也没办法了。再设计的时候，我需要在原有设计上注意什么呢？？前辈。请您给我些宝贵的意见。O(∩_∩)O谢谢

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 docsy 于 2014-12-1 17:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

现在看来，也考虑重新设计了，虽然有些不想，可是好像也没办法了。再设计的时候，我需要在原有设计上注意什么呢？？前辈。请您给我些宝贵的意见。O(∩_∩)O谢谢 ...

的确蛮奇怪的，你是P的cDNA你的引物序列不是根据DNA的序列设计的吧？按说如果是根据CDNA设计的话退火提那么高特异性不会那么差呀，如果是根据DNA设计的引物，你这个电泳图就可以解释了。我也是做的转录组，确实还没出现过这样的情况

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发表于 2014-12-1 17:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dodoit 于 2014-12-1 17:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

的确蛮奇怪的，你是P的cDNA你的引物序列不是根据DNA的序列设计的吧？按说如果是根据CDNA设计的话退火提那么高特异性不会那么差呀，如果是根据DNA设计的引物，你这个电泳图就可以解释了。我也是做的转录组，确实还没出现过这样 ...

引物是根据RNA设计的，我做病毒检测这块的。

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发表于 2014-12-1 17:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人觉得就是设计引物时的序列不合理，注意上下游引物之间避免互相匹配，就不会出现引物二聚体了

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-12-1 17:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物是根据RNA设计的，我做病毒检测这块的。

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RNA可以直接测序了吗？会不会是什么剪接的问题？我做植物的还不是太明白

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