PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】引物非特异严重

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】引物非特异严重

jebel[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118067
精华 0
积分 159
帖子 78
信誉分 100
可用分 1121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
1

发表于 2015-1-7 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】引物非特异严重

前辈们，大家好，我是RT-pcr的新手，这是我的琼脂糖凝胶电泳图。上面的亮带是我的目的条带，可每个泳道的目的条带下面的条带是不是非特异条带呀？如何降低非特异条带呢？？有经验的大家给我出出建议，先谢谢大家。(*^__^*) ……


查看积分策略说明
附件
2015-1-7 15:14
QQ截图未命名.jpg (10.19 KB)
 
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
2

发表于 2015-1-7 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提高退火温度试一下！
顶部
dragonkilly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77754
精华 3
积分 596
帖子 699
信誉分 106
可用分 4371
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-21
状态 离线
3

发表于 2015-1-7 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是RT的结果吗？用的是不是随机引物啊？
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
4

发表于 2015-1-7 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

稍往上加点退火温度试一试。
顶部
3648755[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77481
精华 0
积分 574
帖子 767
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
5

发表于 2015-1-7 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个影响因素很多的
可能是引物设计有问题 设计原则可以在网上找到的
也可能是退火温度的影响 温度越高 特异性越强
另外各种试剂一定不要混用 以免污染
顶部
jebel[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118067
精华 0
积分 159
帖子 78
信誉分 100
可用分 1121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
6

发表于 2015-1-7 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是RT的结果吗？用的是不是随机引物啊？

===================================================================

是呀。这个是RT-PCR产物的电泳图。反转录所用的不是随机引物，是我设计的下游引物。
顶部
jebel[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118067
精华 0
积分 159
帖子 78
信誉分 100
可用分 1121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
7

发表于 2015-1-7 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2015-1-7 15:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

稍往上加点退火温度试一试。

好的，谢谢学长学姐们的指导，我现在使用的退火温度是55度，我提高些试试。还有，想请教设置退火温度是自己算Tm值？还是直接看TARAKA公司的引物合成单子的Tm值呢？？最佳退火温度是Tm-5度是吗？
顶部
jebel[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118067
精华 0
积分 159
帖子 78
信誉分 100
可用分 1121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
8

发表于 2015-1-7 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 3648755 于 2015-1-7 15:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个影响因素很多的
可能是引物设计有问题 设计原则可以在网上找到的
也可能是退火温度的影响 温度越高 特异性越强
另外各种试剂一定不要混用 以免污染 ...

谢谢前辈给指出的多方面影响因素，谢谢，现在我还是想在现有引物的基础上，想办法减少非特异产物的条带。
顶部
free[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71299
精华 0
积分 298
帖子 276
信誉分 100
可用分 2226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
9

发表于 2015-1-7 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jebel 于 2015-1-7 15:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢前辈给指出的多方面影响因素，谢谢，现在我还是想在现有引物的基础上，想办法减少非特异产物的条带。

建议做个梯度 比标准Tm值低五℃左右 应该能得到很好的结果 但是如果还是没有消除杂带 我建议更换引物···要不就切胶回收了
顶部
jebel[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118067
精华 0
积分 159
帖子 78
信誉分 100
可用分 1121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
10

发表于 2015-1-7 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 free 于 2015-1-7 15:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议做个梯度 比标准Tm值低五℃左右 应该能得到很好的结果 但是如果还是没有消除杂带 我建议更换引物···要不就切胶回收了

嗯 谢谢你 学长。会不会是PCR现有体系不好，即便做了退火温度梯度（55-63度）也有非特异性扩增。一直以来，没有优化过体系。您能该我些优化体系方面的建议吗？？
顶部
 12  1/2 12››