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标题:【求助】关于PCR突然无法成功了的问题，急待解决！

fox_79[使用道具]
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发表于 2015-1-7 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于PCR突然无法成功了的问题，急待解决！


从上周之前，我做pcr一直都还是相当顺利的。上周起，不知什么原因，突然PCR出不来结果了。一开始考虑到是否是仪器或是试剂的问题，后经验证，并非如此。而且我曾用前辈的plasmid模板还有primer用相同的方法作了实验，很好的出了结果；于是我考虑是我的模板还有primer出了问题（不过怎么会突然出问题了呢），就重新做了，可结果还是不行。后来我再一次检讨了Tm，Mg的量还有适量添加了DMSO，依然无法得到正常的结果。连以前能成功的实验，我现在在用相同方法做也无法成功了。
所以请教一下，是不是还有什么我漏掉的地方，而且这种突然无法成功的原因是什么呢？
还望指点！谢谢
有需要的话，我可以扫描我的agarose gel上来以供参考。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2015-1-7 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

模板稀释的时候速度加快，下面加冰，我出过同样的问题，速度提高就好了。希望能帮到你

ps：实在速度上不去，可以找个人帮你混样，一次少p点先试试
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2015-1-7 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也出现了这样的事 可是比你还惨 师姐做出来的基因我都扩不出来了 p了一个多星期 连一个条带都没看到 不知道是怎么回事 我跟楼主一样期待解决的办法啊
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fox_79[使用道具]
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发表于 2015-1-7 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

plasmid是不是总解冻的话，会变的不行啊？
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-1-7 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
质粒模板即使冻容多次也不会有问题的  你电泳一下看看
顺便赞下电磁炮 姊姊大人^ ^
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-1-7 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

既然你用了别人的都可以做出来，而且以前也可以做出来，说你的体系和仪器应该是没有问题的，唯一可能就只有模板和引物出问题了，你可以把成像的照片放上来看看，因为没有结果是出现拖尾还是没有任何条带还是其他情况都要分析。
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发表于 2015-1-7 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

试剂污染了！
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lixi559[使用道具]
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发表于 2015-1-7 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也赞同六楼的说法，应该是模板或者是引物出问题了
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-1-7 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果引物和模板都没有问题的话，是不是污染的问题，水什么的
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2015-1-7 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也出现楼主的情况!!快痛苦死了.三对引物.扩的好好的.突然一下就扩不出来了.整了一个多月了...连仪器都拿去检修了!可是就是没结果...偶尔突然有一点.然后马上就用同样的条件再做就又没了!由于需要大量的筛选突变体,DNA有很多不同的.我怀疑是DNA质量的问题.但是为什么刚开始都扩的出来,突然就不行了呢...三对都是.好像扩了一段时间就不能再扩出来了...各位大侠注意,不是三对同时出不来,是一对出不来了.我就用另外一对,另外一对出来了,扩一段时间又不行了.然后再用第三对,出了结果,结果扩了几次,又不行了...我把备用的引物干粉都重新又稀释来用.还是不行....我都不知道为什么啊..!!!..我做的是小麦,材料是大田里取得苗子,DNA质量不是特别好.但是为什么刚开始扩的出来啊....请大家帮忙分析下!
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