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标题:【求助】请各位高手帮我看看这究竟是什么原因？

简森si[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请各位高手帮我看看这究竟是什么原因？

由于本人第一次做分子，如有描述语言不正确请各位多多包涵，我提取的是植物根中AM真菌的DNA，目的是用来鉴定此植物根内的AM真菌是哪一类。用的maker是上海生工买的总共六条带（2000,1000,750,500,250,100），核酸染料是4s green

我想请教的问题是：
1为什么我的pcr产物跑电泳以后在凝胶成像系统下，点样孔一直到终点呈现一条带状的荧光带，第一次PCR后是没有的，第二次就有一些样就会这样了，第三次PCR就更严重了（图片中的左边的那块胶是第三次PCR的结果，右边的是第二次PCR的结果）。
2. 为什么我的maker总是很模糊，样品和maker都是用同样的核酸染料4s green，每次样品带都比maker的带亮且清晰
3.我之前做了DNA的样品去蛋白，不去蛋白的时候pcr以后是有目的条带的，但是去了以后目的条带就没有了。

请各位高手为我指点一下，O(∩_∩)O谢谢！
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misswu61[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR条带跑的这么弥散，基本没有条带，最可能是模板DNA降解，或者提取的质量不好。DNA去蛋白之前，有条带；之后没了，可能去蛋白的过程中污染DNA酶。你是用蛋白酶去蛋白的吗？
至于marker跑的不清楚，应该是胶或者电泳液的问题。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好像你的系统污染了
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DNA提取后，不要反复冻融，你可以分装，以后每次用取一管做模板；第二marker模糊是因为你的上样量太少，建议你以后跑胶用宽孔，不要那么窄的梳孔，跑出来的胶很难看，marker上样量多点，每次5~8ul为宜；第三做个梯度摸索下最适Tm温度，其实PCR扩增是件很简单的事，我们实验室甚至几乎所有PCR都不摸索温度，直接57度扩增，也都能扩出来，高保真PCR会比较麻烦，但也可以解决，我不知道你的结果为什么那么悲催，所以略微提点上述建议。如果你的PCR一直不好，建议你用试剂盒提取真菌DNA，有时候模版不行也很ft。
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

生工的引物一般没什么问题，虽然HAP纯化会有一些杂质引起不必要的扩增产物，但也不影响克隆或者常规检测
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简森si[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 misswu61 于 2015-1-13 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

PCR条带跑的这么弥散，基本没有条带，最可能是模板DNA降解，或者提取的质量不好。DNA去蛋白之前，有条带；之后没了，可能去蛋白的过程中污染DNA酶。你是用蛋白酶去蛋白的吗？
至于marker跑的不清楚，应该是胶或者电泳液的问题。 ...

不是用蛋白酶去蛋白的，用有机溶剂。O(∩_∩)O谢谢
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我记得我以前也有一次是这样子的，后来换了新鲜缓冲液，重新倒了胶就好了。
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发表于 2015-1-13 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

marker不亮，要不是你的marker不好，但很可能是胶配得不行，其他又一片亮的东西，应该是非特异性扩增
不行就做一个pcr梯度看看
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