【求助】隐约有暗带，是引物特异性不高还是退火温度...

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标题:【求助】隐约有暗带，是引物特异性不高还是退火温度...

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天跑的pcr，同一个基因，设计了两对引物，marker后1~3是800bp长的片段，4~5是600bp才片段，最后一个是阳性对照。
1~3的引物退火温度是55℃左右，引物报告单上是57.3℃和53℃；
4~5用的引物退火温度是56.3℃和55.9℃，引物报告单是的退火温度是55.4℃和57.6℃。

PCR仪设定的退火温度是53℃，为什么在1~3泳道里，有两个暗带呢？4~5也有，
是引物特异性不好的原因，还是退火温度低、特异性差导致的呢？
请大家帮忙解答！

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

杂带多引物特异性不好或者是退火温度低

eric930[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以尝试下Takara的primer star，这个酶功能很强大，属于高保真酶，P出来效果可能会有改善

junjie05[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

marker跑的都不清楚，胶都制的不太好，可以做个退火梯度从新跑一下看看~如果退火梯度不理想，那就是引物特异性问题了！

misswu61[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做个退火温度的梯度，如果提高温度差不多的话，就重新设计引物，引物特异性不好

whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做个梯度PCR试试吧

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 misswu61 于 2015-1-13 17:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

做个退火温度的梯度，如果提高温度差不多的话，就重新设计引物，引物特异性不好

今天下午刚跑了一个梯度，但效果还是不好，条带暗，而且有杂带。请问如何设计引物，或用什么软件分析能增加特异性呢？

qhyu[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般用PP5（ Primer Premier5.0）软件，你问问师兄师姐应该都有这个引物设计软件。

mingming0638[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可用降落PCR试试

gemei0115[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天下午刚跑了一个梯度，但效果还是不好，条带暗，而且有杂带。请问如何设计引物，或用什么软件分析能增 ...

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平时都是直接看的，设计完直接在NCBI中BLAST一下就可以了，看看特异性，不行再换。不过PRIMER5.0是个不错的引物设计软件。可以学一下。