【求助】菌液PCR有条带，但提不出质粒

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标题:【求助】菌液PCR有条带，但提不出质粒

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

向各位请教~
我的基因全长1638左右，分别以DNA和cDNA为模板进行pcr，胶回收，连接19T载体，转化大肠杆菌感受态。

上图是DNA为模板的基因，菌液PCR
送华大测序失败，第一次是原始菌液（命名为D4），说样本浓度低，失败，序列可参考。（上NCBI比对是我要的序列）
第二次送的是活化后的菌液D4+，第三次送的是活化后的菌液D1+和D2+，华大返回的结果都是未提出质粒。
我自己也提了一次质粒，质粒跑胶也是没有东西。

1是以D4+菌液PCR，2345是以cDNA为模板的基因进行菌液PCR，并测序成功。
我觉得上图可以排除假阳性的可能
请问大家，为什么菌液PCR有条带，但提不出质粒呢？
非常感谢~

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是哪些泳道呢？说清楚点嘛

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 yyaxw84 于 2015-1-13 17:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是哪些泳道呢？说清楚点嘛

图1是以DNA为模板扩增的基因，转化后的菌液PCR。选了其中的第四泳道的菌株命名为D4送测。
图2是D4和以cDNA为模板的菌液PCR（已测序成功）。
我和同学请教的结果是，可能是我的D4中有平板上的目的基因。（我已经无法考证图2的D4是第一次挑平板培养的还是第二次扩增的）
可能是挑菌落的时候不注意。
现在准备再做一次连接看看。

做实验还是得勤做阴性阳性对照啊。我的描述语言还是很不专业的，谢谢你的关注~~

misswu61[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有阴性对照码

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第二次活化的菌液PCR也有条带。。。所以不会是挑单克隆挑到目的片段了。。。

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 kent 于 2015-1-13 17:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你提取的质粒电泳是不是弥散的啊，转化在哪种大肠杆菌啊？一般在BL21中（记得好像是）很难提取出完整质粒，因为其中有大量DNA酶，其他的我不知道，pcr可以扩增不代表你的菌中有目的条带啊，可能是试剂污染什么的，也可能不是。主要还 ...

质粒电泳是完全没有东西。大肠杆菌用的是DH5α。试剂的话，引物我才配过，菌液PCR用的试剂都是单独的。这是为什么啊怒掀桌了啊啊啊啊~

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 misswu61 于 2015-1-13 17:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有阴性对照码

阴性对照上次没有做。下周一再连接一次看看。

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 chuntian1983 于 2015-1-13 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

阴性对照上次没有做。下周一再连接一次看看。

请教一下，你是怎么连的，我的目的基因是1.8k,好几次都没有连出来，回收的目的基因是30纳克每微升，质粒用的是宝生物的PMD18-T（2600bp左右）,质粒：solution：目的基因=1:4:5，总体积是10微升，16度连接12小时（过夜），挑单菌落做PCR，25微升体系，没有阳性菌。

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 zwsyrt 于 2015-1-13 17:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教一下，你是怎么连的，我的目的基因是1.8k,好几次都没有连出来，回收的目的基因是30纳克每微升，质粒用的是宝生物的PMD18-T（2600bp左右）,质粒：solution：目的基因=1:4:5，总体积是10微升，16度连接12小时（过夜），挑单菌落做PCR，25微升 ...

我也出现过这种菌液PCR没有条带的情况。分析的话应该是大肠杆菌感受态的问题。你是自己制备的感受态还是买的呢？

IAM007[使用道具]
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发表于 2015-1-13 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 chuntian1983 于 2015-1-13 17:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我也出现过这种菌液PCR没有条带的情况。分析的话应该是大肠杆菌感受态的问题。你是自己制备的感受态还是买的呢？

买的是康为世纪的DH5α，你每次用多少？我用20ml,加到连接液中，用枪稍微吹打，冰浴30分,42度90秒，冰浴1分，加LB摇1小时。

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