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标题:【求助】怎么避免引物二聚体，还有PCR的问题？

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发表于 2015-1-14 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎么避免引物二聚体，还有PCR的问题？

P目的基因，取模板CDNA时，用枪头吹打会造成CDNA断裂吗？不知道我的电泳图到底怎么回事？一直P不出目的基因。。。做了温度梯度还不行，第一张图的Tm=48，第二张Tm=51，请各位不吝赐教，真急，谢谢！
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发表于 2015-1-14 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师说只要能P出目的基因，可以加大模板CDNA的量，我加了8ul。请问是不是CDNA的量有个限度，是不是我加了太多造成上面两个图的现象？谢谢。。。
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dodoit[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看看引物单上TM值多少，通常退火温度低了容易产生引物二聚体，一般TM值减3到5度就行
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.重新设计引物
2.加大模板用量或减少引物用量
3.扩大反应体系
4.提高退火温度或Mg离子浓度
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woshiduiyan[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果没有目的条带，退火温度至少再降5度试试，如果有模糊带在往上慢慢升高退火温度。
引物二聚体可以适当降低引物量来减少！也要考虑是不是两个引物是不是太容易聚合而导致没有足够的目的条带扩增出来！
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ALALA[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好像是有主条带，弥散，你做巢式
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gogo[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也反转录不出来。
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1221[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 gogo 于 2015-1-14 10:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我也反转录不出来。

反转录我是有的，用actin检测也有条带，不过模板4ul时才有条带，2ul没有，CDNA模板应该是可用的，但是P不出目的基因，对了，你们P目的基因时，一般模板CDNA最多不超过几ul，加多了有影响吗？
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的pCR最近也是这个样子    找原因     primer5.0上各项检测指标均符合   只有最后因物件二聚体是红色的，但△G挺低的，不到4，也是这样，是引物的问题么？？？
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nn255[使用道具]
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发表于 2015-1-14 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
减少模板量 巢式 如果不行，就考虑模板的问题，最好再设计新的引物试试
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