PCR仪

嗯，我是在冰上做的，而且引物我还煮沸过，都没什么效果，我的引物配对的部分都是一样的，只是5‘端加的50bp碱基不一样。我的irp1引物是P1:atggataacttgcgcttctcttctgcgccgacagcagattccattgatgcAATTAACCCTCACTAAAGGGCG     
P2:gcaaaataccgcgagacgggcttccggcccggaaaataccgtatgttgcgTAATACGACTCACTATAGGGCTC   
我的参数是：98度30s－[98度10s－58度30s－72度90s]×30－72度10min
irp2引物是
P1:tcaggaggaagaatgatttctggcgcaccatctcaggattcgctgttaccAATTAACCCTCACTAAAGGGCG
P2:ttttctcgcgccgtgcggcaggctgatccagcgaaaccggaacgtaaaccTAATACGACTCACTATAGGGCTC
参数：94度5min－[94度1min－60度1min－72度90s]×30－72度10min
irp1能够P出来，但有很亮的引物二聚体，irp2就是不灵敏，有时P出来，有时P不出来，试过好几个Tm

之前师姐做的时候已经换过了，这次的就是这个不给换，用这个引物的话就是有时候能做出来有时候不能做出来

还没有做过2步法的，怕引物太长有影响。我用的是takala的高保真酶P的。就是有时有结果有时没有

因为我做的是同源重组，用的是加了同源臂的50bp引物，这样PCR后的产物就直接是我要的重组片段。我看了相关资料资料，你说的方法是之前做同源重组常用的，但很复杂，麻烦。我用的这方法是试剂盒提供的新方法，并有人做成功的。