【求助】大家碰到过这种情况吗？

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标题:【求助】大家碰到过这种情况吗？

大大大山楂[使用道具]
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发表于 2015-1-14 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天跑的菌落pcr，跑完后竟然发现PCR管中有白色沉淀，电泳后泳道里什么都没有，这是怎么回事？我是将菌体加入到溶菌酶中37度作用40min，之后12000转离心3min，取2.5ul上清作为模板跑的PCR。
25ul PCR体系如下：
2*PCR mix                12.5ul
溶菌酶消化上清（模板）    2.5ul
上游引物（20uM）          0.5ul
下游引物（20uM）          0.5ul
水                                  9ul

电泳结果，Marker旁边的紧挨着的三个空白泳道就是，前面面三个是基因组DNA PCR结果。

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2015-1-14 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

跑菌落PCR
我们通常是这样做的哈取2微升或1微升菌液作为PCR的模板。体系跟你的差不多哈根据我做的情况体系对PCR的结果没有多大的影响哈。我们都不加溶菌酶来溶解细菌的细胞壁因为在PCR反应的时候预变性的温度95℃或94℃足以破坏细胞壁使得基因组裸露出来作为PCR反应的模板哈你可以试一下哈。希望对你有帮助哈

大大大山楂[使用道具]
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发表于 2015-1-14 14:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问二楼你们做的是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌的菌落PCR

xue258[使用道具]
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发表于 2015-1-14 14:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

好像没跑出来。

ALALA[使用道具]
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发表于 2015-1-14 14:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近也遇到了菌落PCR没有目的条带的情况，两次了，阳性对照也没有，好像只有引物二聚体。酶用的事TAKARA的premix taq ，模板用的是挑菌后稀释在20微升ddw中，取1微升作为模板的，引物各加1微升，20微升反应体系，就是没条带啊没条带，愁死了额。

youreyes[使用道具]
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发表于 2015-1-14 14:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ALALA 于 2015-1-14 14:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我最近也遇到了菌落PCR没有目的条带的情况，两次了，阳性对照也没有，好像只有引物二聚体。酶用的事TAKARA的premix taq ，模板用的是挑菌后稀释在20微升ddw中，取1微升作为模板的，引物各加1微升，20微升反应体系，就是没条带啊没条 ...

你还是引物的条件没摸好把，可以试试降低引物的量，把模版的量增加到2ul 试试，我最近也是在做这方面的，改了条件就摸出来了

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发表于 2015-1-14 14:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 youreyes 于 2015-1-14 14:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你还是引物的条件没摸好把，可以试试降低引物的量，把模版的量增加到2ul 试试，我最近也是在做这方面的，改了条件就摸出来了

谢谢谢谢，阳性条带出来了，因为换了酶、换了PCR仪。但目的条带没结果，质粒酶切有结果这个现象我也怀疑是模板的量的问题。