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标题:【求助】今天的PCR出来的条带，有点蹊跷

rxcc33[使用道具]
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发表于 2015-1-14 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】今天的PCR出来的条带，有点蹊跷

最右边是5K的marker，从上往下分别是5000，3000,2000，1000,750,500,250,100bp。左边是我的目标片段，1-8是769bp的片段，10-12是559bp的片段，问题出来了：扩增出来的片段不是目标片段，是500bp左右的片段。（引物特异性没问题，退火56度，延伸1min），而且出现了整齐的250bp和100bp的杂带。求解释…………………………是什么原因造成这种结果？
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-1-14 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
直接亚克隆出去测序结果一目了然
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2015-1-14 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qhyu 于 2015-1-14 15:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
直接亚克隆出去测序结果一目了然

没钱啊，有钱我就直接测序了，准备搞好了一次性测序。真不知道这是神马原因……
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-1-14 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为：污染了-引物污染 or dd水污染 or bufer污染
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2015-1-14 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 whitesheep 于 2015-1-14 15:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我认为：污染了-引物污染 or dd水污染 or bufer污染

要是污染了的话，为什么偏偏是250bp和100bp那里？而且那里的条带也比较清晰。
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pulala[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想问几个问题
1，56是引物的退火温度还是你设置的PCR时退火温度?
2，PCR的模板是什么?质粒?cDNA?基因组DNA？
3，“扩增出来的片段不是目标片段，是500bp左右的片段”这句话的意思是说扩增出的片段500bp左右还是目标片断500bp左右？？
4，引物特异性没问题是如何判断的？
100bp的条带有可能是因物二聚体，250bp可能是非特异扩增。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pulala 于 2015-1-14 16:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
想问几个问题
1，56是引物的退火温度还是你设置的PCR时退火温度?
2，PCR的模板是什么?质粒?cDNA?基因组DNA？
3，“扩增出来的片段不是目标片段，是500bp左右的片段”这句话的意思是说扩增出的片段500bp左右还是目标片断500bp左 ...

1 56是PCR设置的退火温度
2 PCR的模板是基因组DNA
3 我的目标片段是770bp，但是扩增出来的比较亮的带是500bp左右
4 引物特异性检测就是常规的Blast，比对的条带基本上没问题，有的是十四五个碱基重复（我在想问题是不是出现在这个地方？）
非常感谢能仔细看我的问题，实验顺利~
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到这种状况的，我的原因是用 的酶保真性太高了，我先用的mix扩出来的条带很单一，但不是目的条带，后面我改用一般的rtaq之后就可以了，你可以试试
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 bamboo16 于 2015-1-14 16:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我也遇到这种状况的，我的原因是用 的酶保真性太高了，我先用的mix扩出来的条带很单一，但不是目的条带，后面我改用一般的rtaq之后就可以了，你可以试试 ...

可惜我用的就是rTaq……
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发表于 2015-1-14 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
悲剧的一起等结果。。。我的16s rRNA克隆导入 再挑取单菌落进行阳性检测之后 出现的只有250bp的带 快急死了
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