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标题:【求助】帮忙看看PCR结果吧？谢谢！

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发表于 2015-1-14 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】帮忙看看PCR结果吧？谢谢！

大家好，昨天跑的pcr结果：
1、第3条带大约是多少啊？
2、第4条带的目的片段是187bp，有目的条带，但不是太清楚，而且引物很亮，这是怎么回事啊？
还请高人指教，小弟将不胜感激！谢谢！！！
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发表于 2015-1-14 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR反应程序是94℃4min，94℃30s-56℃45s-72℃30s---30个循环，72℃5min
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、Marker用的是什么？对应Marker的条带就可以估计第3泳道的产物带大小；
2、引物和模板的结合需要合适的反应体系及退火温度。你可以在体系不变的情况下，将退火温度小幅度调整跑PCR试试，也可以退火温度不变，加大Mg离子浓度试试。
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wood533[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果使用的是DL2000的话，那么第三泳道的PCR产物大约有200bp
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发表于 2015-1-14 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第三泳道条带大小，由所用Marker大小决定啊！
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、降低退火温度，我曾做过42度-48度退火的
2、更换不同的taq酶试试，我以前使用不同酶扩增的效率差别很大。
3、若还不行，需要调整引物，减少引物间互补碱基数，避免PCR过程形成引物聚集体
祝你好运。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我怎么感觉需要提高一点退火温度呢，温度低了，那俩引物不是更容易结合吗？还有就是这个引物的设计是不是互补碱基太多了点啊，所以才会形成引物2聚体第三条应该是200左右吧。
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october7[使用道具]
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发表于 2015-1-14 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第三条应该在700bp左右吧 2000的marker话
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