小中大PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 ...
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看了，你的反应条件，我总是觉得有点震撼，56度退火3min，时间也太长了吧，足够退火10wbp的片段了（当然，没人扩增这么长的片段）。我算路过，帮你优化一下反应条件吧：95度 5min（不是高CG基因组的话足够，对于普通酶，HOtstart的酶除外），94度 30s，63-58降落，72度1min（10循环每循环降0.5），然后94度30s，58度30s，72度1min（27个循环），加尾巴7min就够了。。。。要是还扩不出来，去检测模版，要不就重设引物，反正条件应该ok的
