PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】帮忙分析下PCR结果吧！

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 52  5/6 ‹‹123456››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】帮忙分析下PCR结果吧！

89tongzijun[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107993
精华 0
积分 331
帖子 342
信誉分 100
可用分 2546
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
41

发表于 2015-1-14 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你这退火时间也太长了 都3min了
顶部
89tongzijun[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107993
精华 0
积分 331
帖子 342
信誉分 100
可用分 2546
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
42

发表于 2015-1-14 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

延伸也不用3min吧 应该是90s
顶部
wanglaoshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77295
精华 0
积分 449
帖子 597
信誉分 100
可用分 3796
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
43

发表于 2015-1-14 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

94 ℃× 5min
94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 次
72℃× 10 min

这个体系中94℃长达40min之多，我猜酶已经失活了！！除非你用的酶能够超耐高温，否则一般的taq酶早已失活。
如果你的菌落，引物均没有问题，建议用一下这个反应体系：

94 ℃× 3~5min
94 ℃× 20s -- 56 ℃×20s--72℃× 1.5min, n = 30 次
72℃× 10 min

注：一般taqE的扩增效率为1kb/min
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
44

发表于 2015-1-14 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物二聚体很多,条带很暗,我觉得引物设计出现问题
顶部
小螺号[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74175
精华 0
积分 291
帖子 321
信誉分 100
可用分 2356
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
45

发表于 2015-1-14 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物二聚体很多,条带很暗,我觉得引物设计出现问题

----------------------------------------------

可是这个是网上的通用引物啊
顶部
wanglaoshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77295
精华 0
积分 449
帖子 597
信誉分 100
可用分 3796
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
46

发表于 2015-1-14 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为引物二聚体的条带很大，正常条带几乎没有，因此正反引物可能在某些区间上匹配的概率很大，建议多设计些不同的正反引物，做PCR，选出最好的
顶部
birdfish[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74196
精华 1
积分 539
帖子 654
信誉分 102
可用分 4196
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
47

发表于 2015-1-14 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是引物加的太多，改为0.5试试看。还有，既然是菌落pcr，我不知道你的模板量是怎么测出来的，我平时做就是用白枪头粘一点就ok了，模板太多也会抑制pcr反应。
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
48

发表于 2015-1-14 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
都没有明显的条带出来，二号孔有一点。。不过算了吧。
首先，要做对照。检验体系是否有问题。
其次，有可 ...

==========================

我是初学者，请问如何作对照呢？
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
49

发表于 2015-1-14 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般PCR
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
50

发表于 2015-1-14 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般PCR程序是95度5分钟，94度30s,56（根据引物退火温度来定）40s,72度1分钟(根据片段大小来定），72度充分延伸5-10分钟，你这个程序不太对吧，根据什么说明书来的？前面的都是引物二聚体，你重新来过吧，按我的程序试一下。
顶部
 52  5/6 ‹‹123456››