光谱分析

　　Ⅰ 分光光度法



　　一、目的 熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。 二、原理 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260=0.02 当OD260=1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml 寡核苷酸浓度约为30μg / ml(youyu底物不同有差异) 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。 经验值： 纯DNA：OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1。6，表明有蛋白质、酚等污染) 纯RNA：1.7 2.0时表明可能有异硫氰酸残存) 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。 三、材料、试剂及器具 1、 材料 提取的PUC19样品、PUC19标准样品 2、 试剂 灭菌重蒸水，TE缓冲液 3、 器皿 石英比色皿;UV-240紫外分光光度计 四、操作步骤 1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min. 2、 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。 3、 设定狭缝后校零。 4、 将标准样品和待测样品适当稀释(DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl)后，记录编号和稀释度。 5、 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。 6、 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。 7、 计算待测样品的浓度与纯度。 DNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度(μg / μl)：OD260×稀释倍数×40/1000

　　Ⅱ溴化乙锭法



　　一、目的 学习用溴化乙锭-标准DNA浓度比较法检测标准DNA的浓度。 二、原理 溴化乙锭(EB)是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA或RNA链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫外辐射并传递能量给EB，而EB本身在302nm和366nm处有光吸收。吸收的能量在590nm 处释放，并表现为橙红色荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比。 三、材料、试剂及器具 1、 标准DNA样品:已知浓度的线型DNA，以TE稀释为梯度浓度的一系列标准样品。 2、 质粒DNA的酶切样品(待测) 3、 溴化乙锭(EB)5μg / ml：以PH8.0的TE稀释10mg/ml母液而的。 4、 紫外透射仪。 四、操作步骤

　　黑色塑料板(或其他替代物)

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　　在其上点上两排溴化乙锭2μl液滴，每排六点

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　　取标准样品2μl与第一排溴化乙锭混匀，则各点的DNA浓度分别为

　　(单位：ng/μl):20、15、10、5、2、1

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　　取待测样品经过梯度稀释后，各加2μl于第二排的溴化乙锭上混匀

　　梯度稀释(单位：μl)

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　　把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上

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　　关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察每一点的荧光强度或拍照。

　　比较上下两排得亮度，确定待测样品的浓度

　　五、注意事项 1、 标准样品含单一种类的DNA，且大小与待测样品相近。 2、 待测样品和标准样品使用同样的体积. 3、 EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。 4、 沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。 六、实验报告 1、 绘出所观察到的现象(以点的密度代表亮度) 2、 请估算待测DNA原液的浓度。 要求记录测定原始数据，计算待测样品的浓度和纯度;并对你的实验结果作出评价，提出下一步提纯工作的设想。