【求助】双荧光素酶报告法验证miRNA靶基因

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】双荧光素酶报告法验证miRNA靶基因

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】双荧光素酶报告法验证miRNA靶基因

fangxiang[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71737
精华 0
积分 380
帖子 479
信誉分 100
可用分 3151
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态离线

发表于 2015-1-29 16:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各路同道英雄前辈，目前我要做双荧光素酶报告法验证靶基因，有几个疑问，请大家给予帮助：

1、pGL3-control 载体的荧光素酶载体下游基本没有可以双酶切的单克隆位点，Xba1比较常见，准备用单酶切，但我的mRNA序列里竟然有几处Xba1的酶切序列，请指点~~

2、看有些文献里得到3'UTR是通过提取DNA然后扩增出来的，我想用NCBI中找到的mRNA 3’UTR然后设计引物反转录后pcr扩增双链DNA然后构建到载体上行不？

3、有一个靶基因mRNA的3'UTR全长（无poly A尾）2800对bp，太长了，能不能不用全长克隆到荧光素酶报告载体上？

4、还有共转染miRNA，要合成miRNA。我想知道是合成miRNA成熟体序列及其互补链序列，然后复性形成双链RNA然后直接用脂质体包裹转染吗？如果那样，转染到细胞内会不会被降解呢？

迫切想知道答案，欢迎大家参与讨论！

49888[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77494
精华 0
积分 776
帖子 1211
信誉分 100
可用分 6906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2015-1-29 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主，第一条，果断换酶
第二条，应该是可以
第三条，最好不要，因为你不能确定结合的靶位点到底在什么位置，而且RISC可能需要整个UTR来作用，当然你也可以试试
第四个我就不知道了
楼主能不能把你查到的相关文献发给我一份jiangyuan2012@163.com
谢谢

leifengta[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77488
精华 0
积分 514
帖子 748
信誉分 100
可用分 4517
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2015-1-29 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1,把原载体上的mcs切掉，然后在荧光素酶后面连上另一个合成的mcs，改造后就可以方便的作为靶标预测的载体了。不过可以选用其他载体。没必要改造。
2、可以做RT-pcr来扩UTR。
3、不必扩全长utr，在你预测靶位点上下游各200bp设计引物扩增就可以。
4、mimics 是单链。有专用的转染试剂盒。不用考虑降解的问题。一般效用可达72小时，足够发挥效用了