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标题:【求助】 PCR体系如何确定

dodoit[使用道具]
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发表于 2015-2-13 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 PCR体系如何确定


设计了引物，那么这个引物的工作液浓度应该怎么确定呢？在整个体系中其他个组分的量又如何确定呢？
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Ao7[使用道具]
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发表于 2015-2-13 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看分子克隆标准PCR体系，再优化
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finger[使用道具]
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发表于 2015-2-13 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
通常在你购买的聚合酶说明书中都会表明该酶使用时体系中各个成分的量，再有就是查书了
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bongte[使用道具]
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发表于 2015-2-13 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般做25ul体系
buffer   2.5ul
dntp    0.5ul
F         0.5ul
R       0.5ul
template  1 ul
taq     0.25ul
ddh20   19.75ul
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发表于 2015-2-13 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的Takara的Taq酶，说明书上有建议使用量的，不合适的话可以再这个基础上优化，不过基本没什么问题
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发表于 2015-2-13 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般来说，根据引物是多少nmol，然后加nmol*100ul的水或者1*TE，将引物稀释成10uM的浓度进行使用,体系的活，根据你所用的酶，进行配制，一般酶都送专用的反应buffer，也会提供已经优化好的体系，所以只要你好好看没得说明书就好了，不用太纠结体系，不同的酶，就有不同的体系。
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发表于 2015-2-13 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物的工作浓度一般是10uM, 引物合成单上就注明你怎么稀释！ PCR体系一般按说明书上推荐的来！ 要是优化的话，先从引物的退火温度上开始。现在酶扩增效率都很高，一般不需要优化！ 你可以买PreMix的 预混酶来用， 只要加模板和引物就可以直接用！
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