小中大问题:
在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢 请高手指教!
解答:
1.RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR.但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好.(promega).
2.RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA(保留后可做5',3'RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等.
3.RACE
我做过RACE(3'RACE是宝生物的Kit;5'RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因的3'RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3'UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3'UTR太长的缘故,我都快绿了,有无
RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗 比如不同的细胞,不同的刺激.
有关内参:
RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度.
问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物.虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量,Mg2+加倍).请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度
答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.
在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的^-^,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了.Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了.能看到均一条带就很好了.
关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上3,5摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间.
有关内参的建议:
一定要做内参的,每一次,我想.不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边我得观点,1,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢.2,以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,3,半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,GC含量相似,或者实在穷的要省PCR管和taq.
关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的.看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动力学的问题,这个我也不懂,有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西.我们学医的,也没必要知道那些,但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的,酶一直是过量,再加酶也没用,引物ntp都是这样.烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点.给你一张图你就明白了,再开始的时候酸的是切线,这图我在 *** 帖过.
关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组PCR),长度小于500bp-600bp等等.
引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机器里啊.我的引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,也不用查.
我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件的时候,还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢
18s的引物也和著名的βactin一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限制是只能用总RNA为模板,但是比actin和bubulin等可准多了,更不要说GAPDH这个破烂了.18s除了在细胞中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不对,请几位主任和eeflying指教.我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的东西,说一座房子是由2000块砖造成的,比说又29根梁更准确吧.更不要说没有看家基因不看家的缺点,因为他是服务于整个基因组表达谱什么的.
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒,就是用18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有没有人用过,告知其序列和genbank号.
正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完,当初和成了一堆.
有那位高手用过18s的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)
原位杂交最好用RNA做探针,效果好一些,反正你有钱卖roche的盒子,而且量也能保证,因为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了.正义反义也容易理清.
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难,有时就是得不出结果.因此,我认为因为每个人所要克隆的片断不同,引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子.
记得我开始我的RT-PCR时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果.后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断(尽管她用这些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物),因此,我先用她的引物和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9mers随机引物),用我的引进物进行一般PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确.尽管我的这个经历别人很人遇到,但足可以说明实验可以有自己的模式,书本的知识和别人的经验很重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制
