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标题:【求助】PCR实验求助

爬呀爬[使用道具]
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发表于 2015-2-14 19:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR实验求助

肿么感觉自己最近这么倒霉尼，做个实验咋这样不顺利尼？各位好心的朋友请帮帮我吧。
这是我今天跑的电泳图，2000的Marker，图中24  33号pcr已经做过好多次了（33号目的片段比24号稍大一些），以前每次都挺成功的，今天想送个测序，测序公司说PCR产物要50ul。于是我就讲24   33各做了两管（每管25ul的反应体系），做完之后跑电泳验证一下，没想到就成了这个样纸，肿么回事呀，用的以前的PCR条件呀
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爬呀爬[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
以下是我个人的一些想法：
加样的时候我是分开加的，即每管先一个个加了引物，再加酶、水、DNA，每次都换枪头，加样时每管必然都有些误差，但我只能保证减小到最小，我感觉每管分开加样可以保证酶、引物的量，避免了4管酶、水、引物加一起后再分装带来的不均匀
这次PCR既然是完全同样的条件（反应体系，加样手法、PCR条件），一个出了结果，另一个没出，那么酶、引物、水、PCR条件应该是没问题的吧
记得以前做PCR时总像师姐抱怨我们的枪太难用，加2ul的DNA总是打出来一部分又被吸回去一部分，现在想想应该是因为DNA本身有些粘稠的原因吧，但是现在有个奇怪的现象（我的DNA是5月份用煮沸法提的）现在加DNA一点都不费劲了，还以为自己手法熟练了，仔细想想应该是现在的DNA不那么粘稠了（还是5月份提的那批DNA），这是什么原因呢？有没有知道的朋友，这说明了什么，DNA 降解了还是怎么回事？
还有就是我们实验室的习惯是，加样之后先微离心，然后用漩涡振荡器震荡混匀，再微离心，最后把EP管放入PCR仪里。这个过程中一直让我很纠结的是震荡混匀这一步，这一步我怕把DNA 震断了，扩不出大片段，可是又担心不震荡混不匀，朋友们这一步你们是怎么理解的，可以指点一下吗？
现在感觉到当时为什么学生化那些基础课程了。。。
跪求各位朋友指点迷津
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发表于 2015-2-14 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.首先没必要每个试管一个个加，楼主怕不均匀，可是只要分装之前用枪头混匀再分装就OK了。2.加样以后混匀不用靠vortex，直接手臂摇晃混匀，再靠手臂力量把贴在试管壁上的溶液晃下去就可以了。再说vortex对于DNA来说激烈了点，过程中也会释放热量影响到PCR酶的。3.楼主实验室没有2ul的专用枪？做PCR加样时最好用2ul的枪，这样加样的时候可以轻松点。要是觉得DNA浓稠，可以稀释，加样的时候按照稀释比列加大加样量就可以了。4.5月份提的DNA可能多少都有些讲解了，即使是保存在冷冻室，在冻融过程中DNA也会有损失。个人想法，供参考，祝顺利。
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发表于 2015-2-14 22:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 爬呀爬 于 2015-2-14 22:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
以下是我个人的一些想法：
加样的时候我是分开加的，即每管先一个个加了引物，再加酶、水、DNA，每次都换枪头，加样时每管必然都有些误差，但我只能保证减小到最小，我感觉每管分开加样可以保证酶、引物的量，避免了4管酶、水、引物 ...

PCR前不需要震荡混匀啊，加完试剂后用枪轻轻吹打均匀就可以，然后瞬离一下就可以进行PCR了，而且分子是可以扩散的，在那么小的体系里面，它自己都可以混匀了，个人拙见，仅供参考。
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发表于 2015-2-14 22:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上朋友的热心帮助！
因为面临着毕业，所以这几天稍有些着急，希望能快点结束实验，可真是应了那句话呀“欲速则不达”，不信不行！
其实两周前我就把PCR条件摸索好了，那时每次都要经过剧烈震荡这一步，结果都挺好的。
现在想送个测序，再做反而效果不好了，有时甚至不出，有朋友说是因为手法不稳定，可这个“手法不稳定”确实不好具体说怎样改善，有时候小心翼翼的做实验结果反而没有漫不经心做的好。。。无法解释
明天继续，经验慢慢积累吧
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发表于 2015-2-14 22:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不必一个个加，但要保证体系均匀。仔细些做就可以了
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发表于 2015-2-14 22:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR反应液可以一起加入混匀后分装，分装后再加入模板就不会存在模板DNA震荡断裂的问题，而且大体积配试剂能减少误差。
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lagua123[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先电泳检测模板和引物有没有降解，如果没有降解扩增时做个阴性对照看酶是否还有活性，相信以上的问题不是问题，那么扩增自然也不是问题了
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