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标题:【求助】真心崩溃啊，提DNA之后PCR扩不出条带...

shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】真心崩溃啊，提DNA之后PCR扩不出条带...

我用天根的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提的昆虫肠道DNA，然后用细菌的引物进行PCR扩增，总是扩不出条带，之前试过排除各种因素的影响，都是没有条带，或者有一两个有特别弱的条带，然后今天加大模板量，1区增加了4倍，2、3区增加了8倍，4是提的DNA，结果还是这样子，求指导，怎么才能扩出条带啊？？？
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你gdna提取后多少水溶解的
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duoduo[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是引物的问题，一些引物在DNA中就是扩增不出特异带来
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vcve[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你做的是什么细菌的引物?阳性对照有做了吗？
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 chengjie79 于 2015-2-14 22:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你gdna提取后多少水溶解的

提出来就直接是液体啊。。用的是试剂盒，最后洗脱的时候加了50ul的洗脱液，洗了两遍。
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 duoduo 于 2015-2-14 22:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是不是引物的问题，一些引物在DNA中就是扩增不出特异带来

不是吧，我用这个引物可以做出菌落PCR啊。。。
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 vcve 于 2015-2-14 22:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你做的是什么细菌的引物?阳性对照有做了吗？

我做的是昆虫的肠道细菌，没有做专门的阳性对照，但是一起做的菌落PCR就有条带。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是目的DNA没提取到或是提取到的浓度太低

我猜的
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cbou876[使用道具]
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发表于 2015-2-14 22:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能主要问题还是模板和聚合酶的问题。实际上你想要的是昆虫肠道细菌的DNA为模板，可能模板量可能很少。那你用什么聚合酶，尽量用低保真的聚合酶，这样结合效率更高。再者就是2中的有没有你的条带，有的话，能不能切下回收做TA克隆。由于你的模板是基因组，可以看出你的引物可能特异性不是那么好，你看下有没有必要做下梯度PCR。
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发表于 2015-2-14 22:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你使用的是gDNA  那你有没有考虑内含子的问题   建议  采用Cdna克隆
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