【求助】RT-PCR溶解曲线出现问题是什么原因？

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】RT-PCR溶解曲线出现问题是什么原因？

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】RT-PCR溶解曲线出现问题是什么原因？

柠檬籽[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 71325
精华 0
积分 130
帖子 39
信誉分 100
可用分 881
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2015-2-14 23:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用的是25微升的反应体系，使用的是两步法，其中退火温度为60度，40个循环。两个都是目的基因，选用的是同一个模板，cdna稀释10倍，为什么左一引物的溶解曲线没有锋，而右一引物峰显著，是什么原因？引物问题？

附件

2015-2-14 23:27

111.jpg (28.48 KB)

2015-2-14 23:27

2222.jpg (30.71 KB)

viviwang1987[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77490
精华 0
积分 458
帖子 636
信誉分 100
可用分 3953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2015-2-14 23:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

出现多个峰,估计是引物特异性不出，产生非特异性条带。。。你是做荧光定量~~qPCR吧~

SO2[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 118006
精华 0
积分 355
帖子 369
信誉分 100
可用分 2696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态离线

发表于 2015-2-14 23:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

特异性不是很好，继续设计引物！

langlang[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77033
精华 0
积分 668
帖子 976
信誉分 100
可用分 5741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2015-2-14 23:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你什么意思呢？你那两个目的基因没稀释时是一样的？现在不一样了？

柠檬籽[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 71325
精华 0
积分 130
帖子 39
信誉分 100
可用分 881
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2015-2-14 23:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 viviwang1987 于 2015-2-14 23:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

出现多个峰,估计是引物特异性不出，产生非特异性条带。。。你是做荧光定量~~qPCR吧~

是的，qPCR。我最近又做了一个引物，三个人一起加样，别人加样的就没有多个峰，我的就有，难道我加样有问题？

柠檬籽[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 71325
精华 0
积分 130
帖子 39
信誉分 100
可用分 881
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2015-2-14 23:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 langlang 于 2015-2-14 23:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你什么意思呢？你那两个目的基因没稀释时是一样的？现在不一样了？

不是，这是两个不同的目的基因。我是不明白为什么左边的引物做出来的有时候是多个峰，有时候又是一个峰，反应条件又没有变化。

柠檬籽[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 71325
精华 0
积分 130
帖子 39
信誉分 100
可用分 881
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2015-2-14 23:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 SO2 于 2015-2-14 23:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

特异性不是很好，继续设计引物！

那设计引物的时候怎么才能判断引物的特异性好还是不好。引物长度，还是其他？