PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】怎样做到PCR的热启动

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】怎样做到PCR的热启动

987789[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1

发表于 2015-2-15 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎样做到PCR的热启动

手动热启动法：

通常是先加模板DNA，再加入冰上预冷的Buffer、MgCl2、dNTP和ddH2O，接着将正反引物加到pcr管壁上（不使引物沉到管底），打开PCR仪，预热到80度，再加Taq酶到PCR管壁上，10000rpm甩5秒，立即放如预热的PCR仪上，开始循环。

热启动技术有很多产品，如（1）Taq酶在蜡块中，加热到94度，蜡块溶解Taq酶进入反应系统（2）Taq酶-Taq酶单抗复合物，94度10分钟灭活Taq酶单抗，使Taq酶发挥作用。可是以上的产品均较贵，反正我用不起。而又要防止非特异性产物。

根据Invtrogen手册的一张图谱，手动热启动法的效果与Platinum Taq酶（有单抗）相当。
顶部
fklo83[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76573
精华 0
积分 344
帖子 368
信誉分 100
可用分 2661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
2

发表于 2015-2-15 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没作过，供参考
先加好除Taq外的组分，混匀，常规加覆液体石蜡；在PCR仪或水浴中加热至80℃，然后再加酶按部就班的进行。
顶部
fklo83[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76573
精华 0
积分 344
帖子 368
信誉分 100
可用分 2661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
3

发表于 2015-2-15 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

/data/attachment/forum/201108/18/topic_show.cgi

前不久刚讲过，供参考。Big Smile
顶部
555444[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118099
精华 1
积分 359
帖子 413
信誉分 102
可用分 2836
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
4

发表于 2015-2-15 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

i thind the product of PCR is little short may be better than too long. it is better between 200-500 bp.
顶部
shkudo[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114490
精华 0
积分 305
帖子 309
信誉分 100
可用分 2338
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
5

发表于 2015-2-15 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 555444 于 2015-2-15 16:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

i thind the product of PCR is little short may be better than too long. it is better between 200-500 bp.

但是也要考虑到跑胶照相的问题，
200bp左右的带边缘就发虚了，
而且条带亮度是和条带大小成正比的，
同样背景下，大条带比较亮。
所以我的经验是500-1000bp
顶部
sistis[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114492
精华 0
积分 222
帖子 164
信誉分 100
可用分 1588
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
6

发表于 2015-2-15 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做热启动都是先不加酶，在95度变性后设一个72度无限期的步骤。打开PCR仪盖，逐个加酶，然后开始循环。
顶部
2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
7

发表于 2015-2-15 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 sistis 于 2015-2-15 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做热启动都是先不加酶，在95度变性后设一个72度无限期的步骤。打开PCR仪盖，逐个加酶，然后开始循环。

要做96孔板PCR还不累死了。Tongue
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
8

发表于 2015-2-15 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的样品不多。
先加酶再升温不是严格的热启动，除非使用抗体说石蜡封闭的taq。
抗体或石蜡封闭的taq就是解决了高通量的问题。
我是做基因克隆，通量不大，但酶都是高保真的。
顶部
glass[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76223
精华 0
积分 715
帖子 1109
信誉分 100
可用分 6373
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
9

发表于 2015-2-15 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的方法与之差不多。一般PCR都有一个5分钟的变性期，在变性将近结束时，使PCR仪pause，加入taq酶。然后go on。。。。
顶部
avi317[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
10

发表于 2015-2-15 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的样品不多。
先加酶再升温不是严格的热启动，除非使用抗体说石蜡封闭的taq。
抗体或石蜡封闭的taq就是解决了高通量的问题。
我是做基因克隆，通量不大，但酶都是高保真的。

==============================

这也许是临床出身和基础出身的差别吧。

我们总是有结果就可以了，不够严格，

以后还须多多学习，呵呵……

各说各的理，相互多交流吧。

关键看疗效！！！
顶部
 13  1/2 12››