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标题:【求助】RT-PCR没有条带

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发表于 2015-2-15 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】RT-PCR没有条带


我跑pcr三个月了,提细胞总RNA,反转录之后pcr,每次都只有内参出现,目的条带一次都没有.我的目的条带全长2440bp,用taq plus没有做出来,后面换long taq也没有结果.然后在文献中看了可以先扩一个短的看看有不有,结果还是没有条带,做了touchdown 从60度降到45度,引物的tm值是50度,(引物合成公司给的),但是用primer5分析tm是58度.很奇怪.怎么办啊?换了很过酶都没有用.

后面分析模板是属于高GC含量的模板，一般酶跑步出来，换了配套的GCbuffer就做出来了。
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发表于 2015-2-15 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

模版降解了？
重新提RNA，做逆转录看看！
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发表于 2015-2-15 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是模板降解了,那内参怎么会有呢?
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发表于 2015-2-15 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.RNA的质量并不是简单通过内参就能判断。
2.反转的效率如何，所用何种反转酶。
3.反转所用引物为dT或random primer?
4. 是已知基因还是未知的？
5.引物设计位点是靠近5‘位置还是3’位置？
6.既然引物Tm值是50度，为什么要从60度来做touch down？
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发表于 2015-2-15 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2015-2-15 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1.RNA的质量并不是简单通过内参就能判断。
2.反转的效率如何，所用何种反转酶。
3.反转所用引物为dT或random primer?
4. 是已知基因还是未知的？
5.引物设计位点是靠近5‘位置还是3’位置？
6.既然引物Tm值是50度，为什么要 ...

请问用引物dT或random primer反转有何不同呢?
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在也出现这样的情况了，请问楼主解决了吗 ？
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你用的引物是特异性引物还是随机引物还是说RACE技术？
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www.1[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 whitesheep 于 2015-2-15 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在也出现这样的情况了，请问楼主解决了吗 ？

换GCbuffer成功跑出来了。
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 小中大
我的是模板GC含量太高了，换对应的BUFFER就行了。
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发表于 2015-2-15 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我遇到和你一样的问题，现在还是没有好的办法，你能给些建议吗？
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