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标题:【求助】急求高手指教！PCR产物扩不出

am10[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】急求高手指教！PCR产物扩不出

我现在做pcr时遇到一些问题，我用的有一对引物是之前师兄已经做过的，现在我用相同的引物和PCR条件做出的结果却非常不理想，扩增效率很低，条带有很暗，酶切根本做不出来。我自己重新跑的梯度做出来的效果还是很差。这对引物是上游5＇-GTA AGA GCT GGG TGG AAG AAA GAC C-3＇ ，下游 5＇-CTC CTT AAC GTA CTG GGA AGC-3＇。PCR原反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性25秒，60℃退火40秒，共35个循环，终末延伸：72℃延伸10分钟。新的条件是预变性95℃，5min、变性95℃，30s、退火55℃，30s、延伸72℃，30s，共35个循环，最后72℃再延伸10min。

还请高手指教，不胜感激！
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那模版是不是有问题啊，最好做个阳性对照
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发表于 2015-2-15 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酶失活啦？做一个对照噜~
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
会不会引物被污染哇，也可能就是做不出来，因为引物长时间放置的原因
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发表于 2015-2-15 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

阳性对照是关键 否则谁也说不出为何
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发表于 2015-2-15 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目的片段大小没说啊。延伸时间跟目的片段大小相关，30sec只够延伸500bp的。还有退火温度可以再降到50度，50度的时候引物容易接上去。template的DNA的浓度也有关系，一般250-500ng。PCR还是很敏感的。
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发表于 2015-2-15 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的片段是460bp的
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发表于 2015-2-15 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的片段大小没说啊。延伸时间跟目的片段大小相关，30sec只够延伸500bp的。还有退火温度可以再降到50度，50 ...

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如果目的片段是2K左右，那么延伸时间应该设置多久呀？O(∩_∩)O谢谢~
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发表于 2015-2-15 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那要看你用的是什么酶了，相应的酶的说明书上有写的。比如TAKARA酶的话是30秒500bp，2000bp的话就是2min，保险一点的话3min。
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jude[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你的PCR扩出来了吗？我最近也是扩不出来，用反转录的cDNA作为模版，Actin能扩出来，我的目的片段也扩出来过，不过很弱，在紫外下能看到有条带，没办法做酶切，请大家指点！
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