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标题:【讨论贴】PCR技术：扩增较大片段DNA的PCR方法

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发表于 2015-2-15 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论贴】PCR技术：扩增较大片段DNA的PCR方法


pcr技术：扩增较大片段DNA的PCR方法
一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：
　　通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到10*-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶Ｉ Klenow片段）或AmpliTaq（全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。
利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增
　　美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。
控制脱嘌呤反应增强扩增效率
　　在PCR反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率。DNA聚合酶的热稳定性一般都是较好的，可能是模板DNA在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌呤反应从而阻碍反应的顺利进行。Lindahl和Nyberg的研究结果显示：在70℃ pH7.4的条件下， 单链DNA脱嘌 呤反应的速度是双链DNA的４倍；100℃ pH7.0时，100kb的碱基中每分钟将有１个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷（Tris）的酸解离常数（pKa）会随温度升高而改变，平均每升高１℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃时pH8.55的PCR反应体系，到95℃热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。 为了解决这一问题，可以采取下列措施：
　　缩短热变性时间，Barnes等在扩增35kb的大片段时，变性条件为95℃5秒，取得满意结果；
　　尽可能使升温、 降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；
　　适当提高反应体系的pH值，反应最初应控制在pH8.8-9.2范围；
　　适当增加延伸时间（可长至20分钟）。使用这种方法可以扩增最大为35kb的DNA片段，产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的DNA分子内的碱基重排和可能的毒性危险等问题。
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发表于 2015-2-15 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是一名研一的学生，最近刚开始做分子实验，发觉接触的东西非毒即癌，真是有点心惊胆战！
因为实验室以前不是主要做分子的，现在还没形成一个有序的实验体系，很多习惯也在培养之中！关于这些有毒废物的处理，也没有什么管理！尤其是关于EB的处理，以前都是把跑完的胶袋子一套，随便丢在垃圾桶里！后来我按照分子克隆上面的方法，配了KMNO4和HCL的处理液，也算为它们找到归宿！可是电泳液要怎么处理呢？里面应该还有一些EB，即使收集了，也不知应送到何处去处理！各位可否将自己实验室的处理方法贴出来分享一下呢？？
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发表于 2015-2-15 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
麻烦向各位大虾请教问题,我正在做RT_PCR,我从肿瘤组织中提RNA,质量还可以,可PCR了几次都是没有目的基因但内参条带很亮,为了排除模板的问题,我用肿瘤细胞提RNA,PCR后出现了目的条带,为什么呢?是我组织标本跟细胞相比相对不新鲜造成的吗?
另外我跑胶了发现我让上海申能博彩合成的上游引物(26bp)浓度明显低于下游引物(bp23),上游引物100pM1微升上样只隐约可见,而下游引物却非常亮,我两条引物都合成了2OD,为什么浓度相差这么大,是不是他们上游合成的不够2OD呀?急盼回复!谢谢!
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发表于 2015-2-15 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教个简单又顽固的问题,PCR出现涂抹什么原因,相同的条件曾经出来产物带,后来就不明原因的涂抹,相同的方法重配的引物
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发表于 2015-2-15 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助各位：
我做的是VDR基因的ApaI酶切位点和TaqI酶切位点的PCR扩增，DNA是我半年前用chelex100提取的（我已把上清液转移出来置于4度保存），前几个月做FokI酶切位点扩增（256bp）出来结果了，这一段时间做ApaI酶切位点和TaqI酶切位点（都是501bp）扩增老是出不来带，偶尔有个别样品出现条带，我用酚－氯仿提取的DNA做个对照，结果酚－氯仿提取的DNA就可以扩增出来，请问我现在该怎么办啊？
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发表于 2015-2-15 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 131415 于 2015-2-15 17:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

求助各位：
我做的是VDR基因的ApaI酶切位点和TaqI酶切位点的PCR扩增，DNA是我半年前用chelex100提取的（我已把上清液转移出来置于4度保存），前几个月做FokI酶切位点扩增（256bp）出来结果了，这一段时间做ApaI酶切位点和TaqI酶切位 ...

我想问你：你的目的是干什么？是想验证你的DNA呢？还是要做VDR的基因分析？Cool
我想应该是后者吧。Wink
你把前后两种DNA同时P，如果你半年前的DNA在相同条件下还是P不出来，而后者P的很好，恐怕你半年前的DNA需要试者再溶于酚－氯仿溶液，用无水乙醇重新提纯。如果仍然不行，恐怕你的DNA已有降解。
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发表于 2015-2-15 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做pcr已经做了三个月了，但是，最近做的常常是杂带比目的带还亮，可是我的pcr条件也没有变啊？那位前辈可以帮帮我啊！
另外，我以克隆菌液为模板做pcr总是做不出带来，可我无法断定是我的目的基因没有克隆进去还是pcr条件不好，导致不出带，我改怎么办呢？
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发表于 2015-2-15 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的引物序列是primer1:5'－ttttaagcttATGCCAGCTCTCCAGCTGCTGTTTCTGGC－3'
primer2:3'－GAAGTTGTACCAGTGGATcttaagccc－5'(其中小写的是酶切位点），而所要扩增的目的片断序列是cggtcc caagatgcca
gctctccagc tgctgtttct ggcctgcctg gtatggggaa tgggggccag gacagcacag
ttccgaaagg ccaacgatcg gagtggtcga tgccagtaca ccttcactgt ggccagcccc
agtgaatcta gctgcccaag ggaggaccag gccatgtcag ccatccagga ccttcagaga
gatagcagca tccagcatgc agacctagag tccaccaagg cccgggtcag atccctggag
agtctcctcc accagatgac ctcaggcgga gttactggga cccaggaggt ccaggagggg
ctacaaggcc agctgggtgc cctgaggaga gagcgggacc agctggagac ccaaaccagg
gatctggagg tagcctataa caatctcctg agagacaaat cagctttgga ggaagagaag
aggcagctgg aacaagagaa taaagatttg gccaggaggc tagaaggcag cagccaggag
gtagcaaggc tgaggagagg ccagtgtccc tcaacccacc acccctctca ggacatgttg
ccaggctcca gggaagtctc tcagtggaat ttggacacgt tggctttcca ggaactgaag
tcagaactaa cagaggttcc tgcttcccaa atcttgaaga atcaatctgg tcatcccagg
agcaaagagg gagacaaagg atgtggagtg ctaatgtggg taggagagcc agtcaccctg
aggacagctg agacaatcac tggaaagtat ggagtatgga tgagagaccc caagcccact
cacccctaca cccaggagac cacttggagg attgacacgg ttggcacagg catccgccag
gtgtttgagt acagtcagat aagccagttc gagcagggct atccttcaaa ggtccatgtg
ctcccccagg cactggaaag cacaggtgct gtggtgtatg cagggagcct gtatttccag
ggtgctgagt ccagaactgt gctcaggtat gaactgaaca cagaaacagt gaaggcagag
aaggaaattc ctggagctgg ctaccatgga cagttcccat acgcatgggg tggctacaca
gacatcgact tagctgtgga tgagagcggc ctctgggtca tctatagcac agaggaaacc
agaggagcca tagtcctctc caaattgaac ccagagaacc tggaacttga gagtacctgg
gagaccaaca tccgtaagca gtctgtggct aatgcctttg ttatctgtgg catcttgtac
acggtgagca gctactcttc agtccatgca accatcaact ttgcctatga cactaacact
gggatcagca agaccctgac catcccattc aagaatcgct acaaatacag cagcatggtc
gactacaacc ccctggagag gaaactcttt gcctgggaca acttcaacat ggtcacctat
gatatcaagc tctcagagat gtgaggagcc tctatcccta ccagagaagg cagaaaaagg
gggaagttcc aggctcccag gtga
请问我的引物设计的是不是有问题？因为我常常会出现一条与我的目的带相当近的大片断杂带。
那位前辈可以帮忙看一下吗？先行谢谢了！
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麻烦向大虾请教问题,我正在做RT_PCR,我从肿瘤组织中提RNA,质量还可以,可PCR了几次都是没有目的基因但内参条带很亮,为了排除模板的问题,我用肿瘤细胞提RNA,PCR后出现了目的条带,为什么呢?是我组织标本跟细胞相比相对不新鲜造成的吗?
另外我跑胶了发现我让上海申能博彩合成的上游引物(26bp)浓度明显低于下游引物(bp23),上游引物100pM1微升上样只隐约可见,而下游引物却非常亮,我两条引物都合成了2OD,为什么浓度相差这么大,是不是他们上游合成的不够2OD呀?急盼回复!谢谢!
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发表于 2015-2-15 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助各位：
我做的是VDR基因的ApaI酶切位点和TaqI酶切位点的PCR扩增，DNA是我半年前用chelex100提取的（我已把上清液转移出来置于4度保存），前几个月做FokI酶切位点扩增（256bp）出来结果了，这一段时间做ApaI酶切位点和TaqI酶切位点（都是501bp）扩增老是出不来带，偶尔有个别样品出现条带，我用酚－氯仿提取的DNA做个对照，结果酚－氯仿提取的DNA就可以扩增出来，请问我现在该怎么办啊？

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扩增体系没问题。
DNA是我半年前用chelex100提取的（我已把上清液转移出来置于4度保存）？？？
临床上提取出的DNA上清液我们认为4度最多2天（易降解）；一般是－20度到－80度，保存不超过一个月；且不反复冻融。供您参考。当然这DNA不是用chelex100提取的。
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