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标题:【求助】求pcr产物连接转化失败原因

cwcwcww[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求pcr产物连接转化失败原因


大家好，我先用pcr扩增出我的目的基因，我用玻璃奶回收的目的产物，之后用PMD18-T载体16度连接过夜转化到, 但是连接着做了四次板上一个菌也没长，最后一次我做了6个转化，连接酶、载体和感受态细胞均是新的。按说T载体应该很好连，现在很苦恼，不知问题出在哪，希望大家帮帮忙，不胜感激！
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daod[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一般是将扩增后的PCR产物用Gel Extraction Kit 回收，连接PMD19-T载体,16度连接过夜。
不管是哪个载体一般连接体系不会有问题，如果片段长的话连接过夜时间足够。你可以跑个电泳看看回收的DNA怎么样。
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uuooii[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这样的情况就加个阴性和阳性对照吧
看看问题出在什么环节
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dream2013[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提取之后 再PCR一次看看
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嗅嗅[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况很正常啊，不知道你用的是什么Taq酶，有的酶拉出来的PCR片段是钝末端的，需要两端加A后才能连入T载体的。
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从感受态和转化上找原因
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sistis[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转化不成功就啥也不长了，应该全是白斑或蓝斑啊？我也遇到了同样的问题，大家想想办法啊！！！
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nikonun[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看来连接转化问题多啊，我也正在连接转化中纠结着。郁闷，蓝斑都没长几个，白班根本没有……
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u76mp[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

连T载体要用普通的taq酶PcR 可以在两端加A  ，而pfu taq酶就不能加上A 所以不能连T载体 。片段太大也不好连。
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sr9971[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在PCR出来的产物做连接，做了试剂盒中的对照，对照的效果很明显，由于我的PCR产物做了胶回收。现在出现的问题是蓝斑少，白斑更少。感受态也没有问题。准备做下直接PCR不胶回收做一次，如果还不行的话，就应该是DNA纯度问题，在DNA里有抑制连接的物质，但是不知道腐殖质对连接有多大的影响。高手指点下。
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