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标题:【求助】荧光定量（探针法）扩增曲线高低不同，求...

jingling845[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量（探针法）扩增曲线高低不同，求...

做了3个基因，用了探针法（报告基团FAM），结果荧光量差异很大，而且斜率也不一样，很是郁闷。但是做染料法的时候，线还挺好的，引物也没问题，不知到为什么。。求助（上图是探针的，下图是染料的的）。。。


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2015-2-16 10:48
探针法FAM.jpg (22.93 KB)
 
2015-2-16 10:48
染料法.jpg (23.88 KB)
 
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fklo83[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

坐等讨论
最近也刚做了real time
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fklo83[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
染料法的特异性全靠你引物了，而探针法主要就看taqman这个短序列了，我觉得问题应该出在探针设计上吧。
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是有引物2聚体干扰啊。
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fangxiang[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是自己配的反应液，还是自己买的mix哦！你REAL-TIME后跑了电泳了吗？几条带！从图上看估计是你酶的扩增效率不一样！
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jingling845[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

   Mix是买的，上下游的Primer各加0.8ul（10uM），然后探针加0.4ul，是FAM的探针(10uM),20ul体系，其实这样加，是因为试剂的说明书这样写的，觉得问题应该也不会太大吧。。。
   电泳是跑了的，像这种Rn值不高，但是Ct值还行的，一般特异性还好，电泳是一条带，亮度还行，没有二聚体的。
   扩增效率是不高，关键是它不一样啊，跑了三个基因，一样的体系，结果线的倾斜程度差异那么大，可想而知，扩增效率也是各不相同的。
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jingling845[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实探针可能真的有问题，因为引物的话，都是用染料法测试过的，就是下面的线，溶解曲线也很漂亮，没什么问题。。。。用了探针就成了那样了。。。难道是反应条件？？可能不？？我用的两步法，其实跟染料法是一样的条件，也是说明书上写的，95℃ 2min，95℃ 10s，55℃ 30s，60℃ 40s（40cycles）。。。
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jingling845[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实看了探针的线，给我一种想法就是，也可能是模板消耗的原料比较快，所以mix里有一种原料用完了，所以刚起峰就到平台期了。。。大家觉得要是固定原来的模板量，然后增大体系如何呢？？
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jingling845[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bamboo16 于 2015-2-16 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是不是有引物2聚体干扰啊。

也有可能。。。但是染料法挺好的，引物溶解曲线完美，单峰，难道是探针的二聚体？？
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jingling845[使用道具]
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发表于 2015-2-16 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 fklo83 于 2015-2-16 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
染料法的特异性全靠你引物了，而探针法主要就看taqman这个短序列了，我觉得问题应该出在探针设计上吧。

请问前辈，探针就一条，应该不会自连吧，那它会不会和引物形成二聚体啊。。。不知道前辈遇到过这种情况没。。
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