【求助】如何用酒精沉淀法回收PCR产物？

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标题:【求助】如何用酒精沉淀法回收PCR产物？

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发表于 2015-2-16 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请求步骤啊。还有多大片段适合酒精沉淀法？我的片段是1737bp的，之前做的试剂盒回收一直产量很少，看师姐用酒精沉淀法回收的量挺多的，她的是700bp的，所以想问问我的这个片段大小可不可用酒精沉淀法？

ero11[使用道具]
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发表于 2015-2-16 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个是你自己考虑多了。
用PCR产物纯化试剂盒的话纯度比较好，用酒精的话量比较大（但是操作上就要很小心了），胶回收试剂盒纯度比前面两种都要好，但是由于多了跑胶的步骤，量会少些。
我的建议是：不就是PCR么，你多做几管，然后跑胶回收，用胶回收试剂盒，这样量和纯度都解决。片段大小不是问题，80的我做过，5k的也做过。

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发表于 2015-2-16 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #2 ero11 的帖子

我的是长引物，片段本来就不好扩。跑出的PCR产物量本来就不多，条带很暗，引物二聚体很亮。正因为我的产物很少，再用胶回收就更少了，我也试过。所以想用酒精沉淀法做做

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发表于 2015-2-16 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR产物不多，条带很暗，引物二聚体很亮
既然这样的话，你需要优化PCR的条件了，要不然两种方法都不是很好
因为你的目的条带很暗，回收试剂盒纯度高但是量少：
因为引物二聚体很亮，酒精纯化的话杂质太多，酶切效果以及后续操作都有影响。

仅供参考！

ero11[使用道具]
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发表于 2015-2-16 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意楼上
还有一个方法就是将你的产物以胶回收试剂盒回收，再用回收产物进行PCR，当然最好用保真度好一点的酶，比如KOD什么的。

HP007[使用道具]
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发表于 2015-2-16 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以下是我之前实验用的方法，仅供参考：
加入1/10体积的NaAC(3mol/L),2倍体积无水乙醇，-20℃保存2h后，12000rpm/10min离心，70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥后溶于50微升ddH2O中。
你还可以在这之后做下胶回收。不过你说你目的带很暗，还是同意楼上意见，做下引物优化方面的先

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发表于 2015-2-16 14:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老板还没准备换引物，让我就拿这个做，真是头疼啊。这种情况加DMSO可以缓解吗？浓度一般加多少呢？

daod[使用道具]
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发表于 2015-2-16 14:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以过膜，浓缩一下，还能去除引物二具体

yayya[使用道具]
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