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标题:【求助】PCR怎么找到最优条件

11_hjx[使用道具]
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发表于 2015-2-16 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR怎么找到最优条件

做了一次pcr 设置了不同的温度，条件都如图所示。 为什么 在55,56,57,58 条件下都得到了两条带呢？（内参没有跑出来 可能是引物有问题） 是不是指 54就是需要的那个温度？。。下次实验需要怎么改进？ PS：引物的TM   F:55 R：54. 请问各位大虾 怎么样去找个条件呢


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发表于 2015-2-16 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
温度一般两度一个梯度，还可以改善模板浓度，延伸时间等，温度个人觉得在有目的条带，越高越好
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popo520[使用道具]
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发表于 2015-2-16 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你做touchdown还是普通pcr啊，怎么会有54度，touchdown pcr不是温度递减么？
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发表于 2015-2-16 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 popo520 于 2015-2-16 14:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你做touchdown还是普通pcr啊，怎么会有54度，touchdown pcr不是温度递减么？

谢谢 解答， 其实 我是不太懂touchdown的具体意义，以为 只是指温度梯度差了。...我设定的是以55为中间温度 然后+—5度来做的。做的时候  第一个样品间隔了2度 其他的间隔了一度...设计的不严密 准备再做一次：） 。 我下一次的 实验按照2度的间隔，+— 5度来做的话 您觉得怎么样呢？
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发表于 2015-2-16 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 october7 于 2015-2-16 14:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
温度一般两度一个梯度，还可以改善模板浓度，延伸时间等，温度个人觉得在有目的条带，越高越好

那就是说，虽然54度的条带只有一个，58度的条带有2个  还是建议我再试试58度的这个么？ 为什么58度的杂带多(⊙o⊙)？
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发表于 2015-2-16 14:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 11_hjx 于 2015-2-16 14:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那就是说，虽然54度的条带只有一个，58度的条带有2个  还是建议我再试试58度的这个么？ 为什么58度的杂带多(⊙o⊙)？

你有酶切位点吗？有的时候酶切位点会影响，你杂带比自己的带大，还可以用延伸时间短，来解决，有的时候是酶切位点等，他特异性
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发表于 2015-2-16 14:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 11_hjx 于 2015-2-16 14:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢 解答， 其实 我是不太懂touchdown的具体意义，以为 只是指温度梯度差了。...我设定的是以55为中间温度 然后+—5度来做的。做的时候  第一个样品间隔了2度 其他的间隔了一度...设计的不严密 准备再做一次：） 。 我下一 ...

你做的是温度梯度pcr哈！我也刚做了一个。55为中间温度，上下5°。但是失败了。跑出了许多杂带，将引物量减半，循环数减少之后还是这样。可能是因为我用的是通用引物的问题。正在摸索中。希望咱们早日找到适合的条件。
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发表于 2015-2-16 14:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yapuyapu 于 2015-2-16 14:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你做的是温度梯度pcr哈！我也刚做了一个。55为中间温度，上下5°。但是失败了。跑出了许多杂带，将引物量减半，循环数减少之后还是这样。可能是因为我用的是通用引物的问题。正在摸索中。希望咱们早日找到适合的条件。 ...

嗯 是的，是的  握手 握手。 昨天又做了一次，所有的温度 全都两条带了... 准备今天改下条件 再试试：） 。 一起加油 good luck
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remenb[使用道具]
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发表于 2015-2-16 14:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果都有两条带，那说明还是有非特异性扩增啊，要么换一对引物，如果是不换引物，如果目标条带够好的话也可以切胶回收。。。
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DNA[使用道具]
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发表于 2015-2-16 14:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得引物特异性不够，不过奇怪的是不是提高温度，会提高特异性吗？~~~~
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