细胞生物学

　　10. 方法的介绍

　　XXX. 我想将hbx转到hepg2 细胞里，通过检测hbx蛋白的水平来检验转染的效率 不知道可不可行?

　　解答：Western Blot检测HBX蛋白的表达来检测转染效率不是一个好办法，建议还是：

　　1、最好是带有荧光标签的HBX转染来看转染效率，最可靠

　　2、其次，HBX和荧光载体共转染，相对说明问题

　　3、荧光载体单独转染，主要是看细胞好不好转了呵呵

　　转染效率高低荧光显微镜下一目了然了。有的细胞荧光强，有的细胞荧光弱，有的没有。所以HBX表达强很可能是少数细胞荧光强的结果，不代表转染效率。

　　YYY. 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢?一般的条件是怎样的?

　　解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的;而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。

　　ZZZ. 转膜时何为湿法，何为半干法?

　　解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法;用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。

　　AAAA. 为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致?同样的电压可以吗?

　　解 答：浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上(实际上也是)小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。

　　BBBB. 如果目的蛋白比较小，21和38kd，转膜时(Biorad的湿转仪)时间是否能缩短些?100伏电压，甲醇的量是否也可以相应增加?

　　解答：如果是小蛋白可以用小电压28V-36V，4-6hours，(4度)。甲醇10%-20%就可以了。

　　11. 结果分析

　　CCCC. 条带有时清晰，有时很散，不知为何?

　　解答：可能原因：样品可能存在降解;转膜不及时造成扩散;转移缓冲液甲醇浓度(NC膜可加到20%，PVDF加到15%)。

　　DDDD. 显色目的条带又细又浅，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，应该是高表达。每个涌道上50-70μg蛋白，开始用半干转移，后来用湿转14v，16h，用PVDF膜转移。胶转移后染色检测，发现小分子量的基本转移走了，可是为什么条带老是不粗不浓呢?

　　解答：可能跟你的一抗有关系，还有应该高表达，那实际做的阳性对照是否是高表达;还有跟抗原量相关，你多上点蛋白会好的多;跟显色条件相关。

　　EEEE. 背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡。

　　解答：这跟你washing的时间和强度有关，很可能你在这方面没有掌握好。显影时间是有范围的，久了肯定不行。

　　FFFF. 纯化过的目的条带包括其上下都出现了色带，而且对照菌也出现了条带，会是什么原因?

　　解答：一抗有问题，效价太低，且未纯化;表达量太低;提蛋白时可能出了问题。

　　GGGG. 做Western Blot的检测的时候，用DAB显色还能看出条带，但是换成ECL的时候什么样结果都没有。我用的NOVA公司的发光底物，胶片是普通的X片，定影液和显影液都是别人留下来的，不知道是什么原因?

　　解答：一般的说，Ecl比DAB更灵敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有几种可能：

　　ECL底物失活了，你可以检测一下;敏感度正好不到ECl底物的范围。DAB能显色可不能催化ECL底物;显影液没用了。

　　HHHH. 怎样分析结果，需要什么软件?

　　解答：如果你做定量或办定量，至少要用到一个光密度扫描分析软件，如果不是，直接分析就可以了。

　　IIII. 积层胶、分离胶一般多少左右合适?

　　解答：一般电泳是积层胶60-80v，分离胶100v。

　　JJJJ. 采用生物素标记的二抗-SABC-DAB检测系统做western，非特异性的条带和背景高?总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很 窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原因，如何解决?sds-page的时候恒压和恒流哪个好?

　　解答：非特异性的条带和背景高：可能性太多了，一抗，二抗，封闭的原因都可能。

　　总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原因，如何解决?正常的，另外，是否是你的积层胶有问题。sds-page的时候，恒压和恒流都可以用。

　　KKKK. 血清样品进行Western Blot分析，目的蛋白21kD，结果显色出来后，目的条带很淡，而白蛋白和IgG条带很浓?

　　解答：可能是因为白蛋白为67kD和目的蛋白相差较大，且他的浓度较低，你可以以底物二氨基联苯胺和0.01%过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟，再用去离子水漂洗以终止反应;也可能是抗体的特异性不好。把封闭的时间延长，同时提高封闭液的浓度，可以减少以下背景噪音。同时洗的时候要彻底，而目的条带弱，说明浓度不足，如果不考虑后续功能的话，你可以过G-50(细)柱子，纯化你的靶蛋白，接着真空冷冻浓缩，可以得到很漂亮的结果。

　　LLLL. Western转膜已经成功了，但是Marker泳道未见蛋白条带(正常应该有6条)，其余各泳道均有清晰的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果相同。经 5%的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后，进行一抗孵育(1：200，建议起始浓度)过夜，二抗孵育5个半小时(1：2000)，均在室温下，DAB显色，虽出现蛋白条带，但较弱，且出现非特异性条带。请问：1、Marker是MBI公司的，可分离14-116KD的蛋白，买了大概有一年的时间，是否有问题?2、一抗(为多克隆抗体)、二抗的浓度及孵育的时间是否合适?

　　3、封闭的时间是否太短?

　　解答：1. marker 有可能被降解了，也有可能是它标称的上样量太少，不够，我做过一个标称每次5ul可我上了20ul才行的。

　　2.建议，一抗4度过夜也很好， 建议1:100，室温2hrs就够了，

　　3. 二抗室温1小时，1:2000，我喜欢4度封闭过夜(室温2hr就够了)，1抗室温1hr，2抗室温1hr，最好是一抗4度过夜(或室温2小时)1:200，2抗室温1小时1:2000， 换ECL法。