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细胞培养中的细节问题 《基础篇-培养基 》

　　基础篇-培养基

　　1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。

　　2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

　　3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。

　　3.2. 材料： 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) ，粉末培养基 ，NaHCO3 ，电磁搅拌器 无菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 ，pH 计，真空泵，CO2 气体

　　3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

　　附-配制培养基之生长测试

　　材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

　　步骤： 1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。