细胞生物学

　　一、实验目的 掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法。

　　二、实验原理

　　人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(G0期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH)时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面的广泛应用。

　　三、实验材料

　　仪器设备

　　5毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量桶，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱。

　　材料和试剂

　　1.人的外周血淋巴细胞。

　　2.Giemsa染色液原液：配方是0.5g Giemsa+33ml甘油+33ml甲醇。配制方法是：在研钵内先用少量甘油与Giemsa粉混合，研磨至无颗粒为止，再将其余甘油倒入，搅拌后56oC水浴保温2小时，再加入甲醇，搅匀后保存于棕色瓶中。

　　3.Giemsa染色液应用液：用0.1M pH7.4磷酸缓冲液稀释Giemsa染色液原液10倍。

　　四、实验步骤

　　1. 培养液的分装：在无菌室内或接种罩内，用移液管将培养液和其他各试剂分装入10毫升培养瓶中，每班8~10瓶，每瓶量为：

　　1640培养液4毫升

　　小牛血清1毫升

　　PHA0.2毫升

　　肝素0.05毫升

　　双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为：100单位/毫升

　　pH：7.2~7.4用3.5%碳酸氢钠调节

　　2. 采血：用5毫升灭菌注射器吸取肝素(500单位/毫升)0.05毫升湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约0.3毫升，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内(内含有生长培养基5毫升)接种，每瓶0.5毫升左右，轻轻摇动几次。

　　3. 培养：直立置37ºC±0.5ºC恒温箱内培养，培养66~72小时。

　　4. 秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度为40微克/毫升的秋水仙素0.05~0.1毫升,最终浓度为0.4~0.8微克/毫升，置温箱中处理2~4小时。

　　5.(两人一组)低渗处理：低渗液的种类较多，如0.075mol/L的KCL溶液，0.95%的枸橼酸钠溶液，用蒸馏水稀释4倍的Hanks液,也可直接用蒸馏水。本实验选用KCL溶液，秋水仙素处理完毕，小心的从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液5毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，分装入两个离心管中，置37℃温箱内处理20分钟，使红细胞破碎，白细胞膨胀。

　　6. 离心：以每分钟1000转，离心5分钟，弃去上清液，收集白细胞。

　　7. 固定：固定液为甲醇：冰醋酸=3：1。每只离心管中，加入固定液2毫升，立即用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15分钟后，离心，倒去上清液，留下白细胞。

　　8. 再固定：加入固定液1毫升，用吸管轻轻打散，室温下继续固定15分钟(过夜也可以)。

　　9. 再离心：倒去上清液，留下白细胞制片。

　　五、实验注意事项

　　1.接种的血样愈新鲜愈好，最好是在采血后24小时内进行培养，如果不能立刻培养，应置于4℃存放，避免保存时间过久，会影响细胞的活力。

　　2.在培养中成败的关键，除了至为重要的PHA的效价外，培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37±0.5℃。培养液的最适pH7.2～7.4。

　　3.培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。

　　4. 制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开，可将固定时间延长数小时或过夜。