【求助】pcr电泳不理想啊

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标题:【求助】pcr电泳不理想啊

vtongli[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最右边的两条是我要跑的，其目的条带应该是1600bp,大家帮我看一下，跑的很诡异啊，木解啊。。。。。。。
pcr 50ul
ddw 18.2
正向引物 2.4
反向引物 2.4
模板 2
pfu master mix 25
反应时间
94° 5min
94° 30s
60° 30s
72° 2min30s
72° 10min
35个循环
以前可以跑出目的条带，最近新稀释的引物，还有RT产物-20°放了半个月~~~~~~~

附件

2015-3-10 11:12

草鱼pcr.JPG (12.9 KB)

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

退火时间有点短，建议1min，延伸时间2min就够了，还有根据你的产物情况，适当调一下退火温度

njkph[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议回收一下模板吧，你看模模糊糊的，或者换换引物（重新配），那么模糊，肯定是体系太乱，不干净，达不到PCR进行的环境；引物带很亮，降低一下引物；很有钱吗？pfu高保真酶啊，我都没用过几次！祝快点解决！

ending[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

RT产物的话，还是随时反转随时P效果好一点，因为cDNA本来就不很稳定，虽是放--20 ，但也还是有影响的。体系正常，我觉得是模板的问题。之前经常做反转，模版质量很关键。

lxh031[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1跟2PCR有什么不同，带型不一样啊。引物少加点，模板测个浓度，也不要加太多，PFU酶有要求的。

大脑门儿儿[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

模板可能有点问题

vtongli[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 njkph 于 2015-3-10 11:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
建议回收一下模板吧，你看模模糊糊的，或者换换引物（重新配），那么模糊，肯定是体系太乱，不干净，达不到PCR进行的环境；引物带很亮，降低一下引物；很有钱吗？pfu高保真酶啊，我都没用过几次！祝快点解决！ ...

模板可能有点问题

vtongli[使用道具]
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发表于 2015-3-10 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 lxh031 于 2015-3-10 11:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1跟2PCR有什么不同，带型不一样啊。引物少加点，模板测个浓度，也不要加太多，PFU酶有要求的。

一样的体系，一样的东西，连cDNA都是一样的。就是图不一样~~

ffaa[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

退火温度提升,可以提升多少，求解！

yes4[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

模版不纯吧，可以纯化一下再跑，延伸的时间有点长啊，可以适当缩短

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